酶法制備元蘑蛋白肽及其分級組分抗氧化活性研究

栗銘鴻 - 姜伊悅 - 張小勇 - 崔福順, -,

(1. 延邊大學農學院，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學食品研究中心，吉林 延吉 133002)

中國食用菌資源豐富，是食用菌生產大國，產量占世界首位；總產值在國內種植業中居第6位。食用菌含有豐富的蛋白質，可與肉、蛋以及豆類相媲美。肽類是介于蛋白質與氨基酸之間的一種生化物質，分子量比蛋白質小，更易被胃腸吸收而具有更多生物活性。食用菌源蛋白肽類的制備、理化性質及其免疫調節、抗氧化等功能活性已成為當前研究熱點[1-4]；并已應用到功能保健食品以及醫藥等領域[5-6]。研究[7-8]也證實，肽類的功能活性依賴于其分子量大小、氨基酸組成及氨基酸排列順序等。

元蘑是中國東北著名食用菌之一，味道鮮美，營養豐富。元蘑中含有蛋白質、維生素、氨基酸等營養物質；還含有酚類、多糖等活性成分；具有抗氧化、抗癌、抗輻射等功效作用[9]。目前國內外對元蘑的研究主要集中在元蘑多糖的提取、結構以及生物活性[10-12]，而對元蘑蛋白的研究鮮見報道。

課題組[13]12前期研究發現元蘑中含有多種生物活性成分，具有很好的抗氧化作用。試驗擬以元蘑為原料，研究風味蛋白酶酶解制備元蘑蛋白肽工藝條件，并分析蛋白肽分級組分的氨基酸組成、紅外特征及其體外抗氧化活性，為高值化元蘑蛋白產品的開發及綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

元蘑：購于吉林延吉；

風味蛋白酶：酶活1∶30 000，北京索萊寶科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、過硫酸鉀、丁基羥基茴香醚(BHA)：分析純，美國Sigma公司；

β-巰基乙醇：純度≥99.0%，卡邁舒(上海)生物科技有限公司；

其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

離心機：TDZ5-WS型，湘儀離心機儀器有限公司；

氨基酸自動分析儀：L-8900型，日本日立集團；

傅里葉紅外光譜儀：IRTracer-100型，日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質水解度DH測定 參照文獻[14]。

1.3.2 元蘑蛋白質提取液制備 準確稱取脫脂元蘑，以料液比1∶80 (g/mL)利用0.07 mol/L NaOH超聲提取40 min，提取溫度50 ℃，超聲功率250 W；過濾后濾液用鹽酸調至pH 4.0，4 000 r/min離心20 min；沉淀用蒸餾水復溶制得元蘑蛋白溶液，作為后續元蘑蛋白肽制備原液[15]。

1.3.3 酶解制備元蘑蛋白肽單因素試驗 在預試驗基礎上選擇風味蛋白酶為水解用酶。以水解度和DPPH·清除率為指標進行單因素考察。

(1) 溫度對元蘑蛋白酶解效果的影響：固定pH 7.0、風味蛋白酶添加量5 000 U/g以及酶解時間4.0 h，考察溫度分別為40，45，50，55，60 ℃條件下的酶解效果。

(2) pH值對元蘑蛋白酶解效果的影響：固定酶解溫度50 ℃、風味蛋白酶添加量5 000 U/g以及酶解時間4.0 h，考察pH 7.0，7.5，8.0，8.5，9.0條件下的酶解效果。

(3) 酶解時間對元蘑蛋白酶解效果的影響：固定酶解溫度50 ℃、pH 7.0以及風味蛋白酶添加量5 000 U/g，考察酶解時間分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h條件下的酶解效果。

(4) 加酶量對元蘑蛋白酶解效果的影響：固定酶解溫度50 ℃、pH 7.0以及酶解時間4.0 h，考察風味蛋白酶添加量分別為3 000，4 000，5 000，6 000，7 000 U/g條件下的酶解效果。

1.3.4 響應面優化酶解制備元蘑蛋白肽工藝 在單因素試驗的基礎上，以DPPH·清除率為響應值，選擇影響相對較大的因素，采用Box-Behnken進行響應面試驗設計，優化酶解制備元蘑蛋白肽工藝條件。

1.3.5 元蘑蛋白肽分級 將元蘑酶解制得的酶解液在3.5，10.0 kDa透析袋中透析，收集3個組分，標記為P1(<3.5 kDa)、P2(3.5～10.0 kDa)及P3(>10.0 kDa)，分別冷凍干燥，制得元蘑蛋白肽3個分級組分。

1.3.6 氨基酸組成分析 稱取樣品置于水解管，加入6 mol/L HCl溶液，真空封口，110 ℃水解24 h后定容；取1 mL在100 ℃水浴蒸干，加2.5 mL 0.02 mol/L HCl溶解后進樣測定。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析 稱取樣品2 mg，以質量比1∶100加入溴化鉀混合研磨壓片。紅外光譜采集分析軟件為LabSolutions IR，掃描50次，分辨率0.25 cm-1，信噪比60 000∶1，波數范圍4 500～450 cm-1。

1.3.8 抗氧化活性測定 DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、·OH清除能力和相對還原能力的測定參照文獻[13]11-12。利用模糊數學的隸屬函數值法進行抗氧化綜合評價[16]。

1.3.9 模擬人工胃腸液對蛋白肽的影響 將元蘑蛋白肽配成0.05 mg/mL溶液，煮沸2 min，冷卻后用1 mol/L的鹽酸溶液調至pH 2.0，加入胃蛋白酶(占底物質量的4%)，37 ℃恒溫反應1 h；用0.9 mol/L的NaHCO3溶液將pH值調至5.3，再用1 mol/L的NaOH溶液調pH值至7.0，加入胰蛋白酶(占底物質量的4%)，37 ℃恒溫反應2.0 h，10 min沸水浴終止反應，冷卻后取上清液，測定其DPPH· 清除率并代入式(1)計算活性保留率[17-19]。

(1)

式中：

B——活性保留率，%；

A1——不同條件處理后樣品的清除率，%；

A0——蛋白肽原液的清除率，%。

1.3.10 數據處理 采用SPSS 20.0軟件進行方差分析并進行LSD多重比較分析；紅外光譜圖采用Origin 6.1軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 元蘑蛋白酶解響應面優化

在單因素試驗結果基礎上，固定加酶量6 000 U/g，選擇pH、酶解時間和酶解溫度3個因素，采用Box-Behnken進行三因素三水平響應面試驗設計，編碼及水平見表1，試驗設計與結果見表2。

采用Design-Expert 10軟件對數據進行回歸擬合，得到模型方程：

Y=26.898-1.464A+0.488B-1.157C+0.445AB-0.114AC+1.376BC-1.946A2-2.427B2-1.176C2。

(2)

表1 響應面分析因素與水平

表2 試驗設計與結果

由表3可知，建立的二項多項模型極顯著；失擬項不顯著；相關系數R2=0.911，說明此模型可以很好地擬合試驗結果。顯著性表明，一次項A極顯著，C顯著，B不顯著；二次項A2和B2極顯著，C2不顯著；交互項BC顯著，AB和AC不顯著。表明響應值的變化較復雜，各個試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系；影響的大小順序依次為A>C>B。

圖1為3個因素影響DPPH·清除能力的響應面和等值線圖。通過軟件分析得到的最佳酶解條件為pH 7.60，酶解時間2.90 h，酶解溫度42.39 ℃，DPPH·清除率理論值可達27.45%。為了驗證上述最佳條件，同時考慮操作可行性，選擇酶解條件為：pH 7.6，酶解時間3.0 h，酶解溫度42 ℃，驗證實驗(n=3)得到的DPPH·清除率為26.85%，與理論值基本吻合。

表3 統計分析結果

2.2 氨基酸組成分析

由表4可以看出，元蘑蛋白肽3個組分中均含有16種氨基酸，其中含有7種必需氨基酸(色氨酸未測)；都不含有半胱氨酸。同時，3個組分中谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸相對豐富，這些氨基酸參與蛋白質的代謝過程，有助腦部發育以及增強肝臟功能、降低血壓等。與FAO推薦標準相比，組分P3中苯丙氨酸和蘇氨酸含量高于FAO推薦標準；纈氨酸、亮氨酸和賴氨酸含量與之相當，這些氨基酸具有改善記憶力和預防脂肪肝的作用[20]。葛曉鳴等[7]研究發現酶解肽的分子量大小不同時氨基酸組成也不同，抗氧化能力也不同。由表4還可以看出，元蘑蛋白肽3個組分中組分P3的總氨基酸和必需氨基酸含量最高，顯著高于(P<0.05)組分P1和組分P2。因此，可以推測3個組分的抗氧化作用也會存在差異。

2.3 紅外光譜分析

由圖2可看出，P1、P2和P3的峰形和出峰位置基本一致，說明三者具有同樣的官能團；3 414 cm-1處的極強吸收峰可能是N—H伸縮振動峰，屬伯胺的特征吸收；2 929 cm-1處的吸收峰可能是CH2非對稱性伸縮振動，屬于酰胺B帶；2 368 cm-1可能是三鍵和累積二鍵伸縮振動的吸收峰；1 637 cm-1處的強吸收峰可能是酰胺Ⅰ帶(C═O伸縮振動)的β折疊，酰胺I帶特征峰由多肽骨架的C═O伸縮振動在特定的氫鍵環境下引起的，其對二級結構變化十分敏感，是描述蛋白質二級結構的最主要峰[21]；1 404 cm-1處的吸收峰可能是C—N伸縮振動峰，屬酰胺Ⅲ帶；1 249 cm-1處的吸收峰可能屬于蛋白質紅外光譜的酰胺Ⅲ帶的β折疊；1 035，1 076 cm-1處的強吸收峰可能是C—N伸縮振動峰，屬脂酰胺的特征吸收；638 cm-1處的吸收峰可能是N—H伸縮振動峰。

圖1 響應面及等值線圖

表4 氨基酸組成?

? 同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 紅外光譜圖

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除作用 如圖3所示，隨著濃度的增加，3個組分元蘑蛋白肽DPPH·清除能力均隨之增大，濃度與清除率呈正相關；3個組分中P3清除能力(72.95%)顯著高于(P<0.05)組分P1和組分P2。劉敏等[22]研究發現鰱魚肽經超濾分成的3個組分中分子量大的組分DPPH·清除能力最好，與試驗相似。

2.4.2 ABTS+·清除作用 如圖4所示，隨著濃度的增加，3個組分清除率均隨之增大，濃度與清除率呈正相關；3個組分之間組分P3對ABTS+·清除能力最高(P<0.05)；其次為組分P1，組分P2最低；當濃度為10 mg/mL

字母不同表示不同樣品之間差異顯著(P<0.05)

時，組分P3的清除率最高(97.82%)。申彩紅等[23]發現海參寡肽中小分子量(0.13～2.00 kDa)具有較好的ABTS+·清除能力；與試驗結果不同，可能是蛋白來源不同，所用蛋白酶種類也不同，產生的多肽氨基酸序列不同，功能作用亦有差異。

2.4.3 ·OH清除作用 如圖5所示，隨著濃度的增加，3個組分·OH清除率也增大；濃度與清除率也呈正相關；3個組分之間組分P3的清除率顯著高于(P<0.05)組分P2和組分P1。當濃度為20 mg/mL時，組分P3的清除率最高(60.99%)。張會翠等[24]發現花生肽3個組分中大分子量組分對·OH清除效果最差，與試驗結果不同。說明不同來源蛋白肽分子量大小對·OH清除作用不同。

字母不同表示不同樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4.4 元蘑蛋白肽的相對還原能力 如圖6所示，隨著濃度的增加，3個組分相對還原能力也增加，呈明顯的量效關系。3個組分中P3的相對還原能力顯著高于(P<0.05)組分P2和組分P1；組分P2的還原力最差。當濃度為20 mg/mL時，P3組分相對還原能力達到97.55%。張會翠等[24]發現花生肽3個組分中低分子量具有較好的還原能力，與試驗結果不同。Aderonke等[25]研究表明，同種物質經不同種類蛋白酶作用后，由于酶解位點不同，所得到的多肽氨基酸序列不同，產生同樣分子量大小的多肽片段顯現出不同的抗氧化效果。

字母不同表示不同樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4.5 綜合抗氧化能力 利用隸屬函數對不同分子量元蘑多肽抗氧化能力進行綜合評價。以DPPH·、ABTS+·、·OH和相對還原力4個指標為依據，計算各指標的隸屬函數值。經計算不同分子量元蘑多肽隸屬函數值的平均值從大到小依次為組分P3(0.70)>P1(0.43)>P2(0.19)，說明不同分子量元蘑多肽中組分P3的綜合抗氧化能力最好；其次為組分P1；組分P2最差。

生物活性物質的抗氧化能力與疏水性氨基酸和芳香性氨基酸具有較強的相關性。試驗中不同分子量元蘑多肽的疏水性氨基酸和芳香性氨基酸含量較高；3個組分中組分P3的含量顯著高于(P<0.05)組分P1和組分P2，也印證了組分P3具有最強的抗氧化能力，其次為組分P1，組分P2最差，與綜合抗氧化能力順序相符。但這一結論與其他學者[7,24,26]研究結果小分子肽具有比大分子肽抗氧化活性更好的結論不同。造成這一結果的原因，可能是元蘑中所含有的蛋白質經風味蛋白酶水解并透析分級后的組成不同；也有可能是分級組分中氨基酸含量的差異；還可能是有其他活性成分在起作用。有待于進一步分離純化，并進行功能活性驗證。

2.5 模擬人工胃腸液對元蘑蛋白肽穩定性的影響

圖7為模擬胃腸道消化對3個組分元蘑蛋白肽穩定性的影響。經過1 h的胃蛋白酶作用后組分P1和組分P3的活性保留率保持在90%以上；組分P2的活性保留率達到106%。說明經過胃蛋白酶作用后，其抗氧化能力反而增強，可能在胃蛋白酶作用下，組分P2得到進一步酶解，產生更多具有抗氧化活性的多肽。胃蛋白酶作用后，再利用胰蛋白酶模擬腸道作用2 h，發現組分P1和組分P3的活性仍可保留在90%以上；而組分P2的活性保留率也在100%以上，說明胰蛋白酶將組分P1和組分P3進一步地酶解，抗氧化肽進而分解成其他功能肽，抗氧化活性減弱。經過模擬胃腸環境發現元蘑蛋白肽活性基本沒有影響，并且可以增強組分P2的抗氧化能力，穩定性很好。張晶[17]通過模擬胃腸道對菜籽抗氧化肽發現，經過胃蛋白酶作用后抗氧化活性增強，但經胰蛋白酶作用后活性有一定程度上的減弱，活性下降至80%。

字母不同表示不同組分之間差異顯著(P<0.05)

3 結論

利用風味蛋白酶對元蘑進行酶解制備元蘑蛋白肽，在固定酶用量為6 000 U/g條件下得到最佳酶解工藝為pH 7.6、酶解時間3.0 h、酶解溫度42 ℃，該條件下酶解液對DPPH·清除率為26.85%。對元蘑蛋白肽進一步分級得到的3個組分P1(<3.5 kDa)、P2(3.5～10.0 kDa)和P3(>10.0 kDa)中均含有多種氨基酸；分子量最大的組分P3含有最多的總氨基酸和必需氨基酸；綜合抗氧化結果也表明3個組分中大分子量的組分P3效果最好；清除效果與濃度呈正相關。同時還得出元蘑蛋白多肽分子量不同，氨基酸組成以及抗氧化能力也不同；分子量越大，含有疏水性氨基酸和芳香性氨基酸越多，抗氧化效果越好。紅外光譜圖結果表明，3個組分峰形和出峰位置基本一致，說明具有相同的官能團，二級結構穩定。模擬胃腸道消化結果表明，胃消化和腸消化作用對3個組分活性基本無影響。綜上可以得出，元蘑蛋白中大分子量的蛋白肽氨基酸種類豐富，穩定性好，并具有很好的抗氧化作用，可以作為營養功能成分應用到食品加工中。而且食用菌來源不同以及蛋白肽分子量的大小不同時功能活性也呈現出不同的規律。

體外的功效作用并不能完全代表元蘑蛋白肽體內的生物活性。下一步將繼續對體內相關活性展開深入研究，為元蘑高附加值產品的開發提供理論參考。