IL-27在結核性胸腔積液中的表達水平及臨床意義

程亮 陳華昕 趙新國 陳惠芬 華少鵬 施敏驊

1無錫市第五人民醫院呼吸科214005；2蘇州大學附屬第二醫院呼吸科215004

結核性胸膜炎是一種由結核分枝桿菌引起的胸膜炎癥病變，傳統的診斷方法是依靠顯微鏡下胸腔積液涂片中找到抗酸桿菌，但其陽性率很低，僅7%～13%不等[1]。胸腔積液結核菌培養可顯著提高檢測陽性率至23%～67%[2]，但其培養周期長達1個月。通過內科胸腔鏡對胸膜病變進行病理活檢可以作為診斷結核性胸膜炎的金標準，然而內科胸腔鏡是侵入性的，增加了相關并發癥的發生，并且胸腔鏡技術在多數基層醫院仍未廣泛普及，因此有必要尋找一種快速、有效、簡便的方法來輔助診斷結核性胸膜炎。本研究探討結核性胸膜炎患者胸腔積液及外周血中IL-27的表達及其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象及診斷標準

1.1.1 研究對象及分組 根據結核性胸膜炎和惡性胸腔積液的最新診斷標準[3-4]，對2017年11月至2018年5月無錫市第五人民醫院呼吸科收治的胸腔積液患者進行篩選，最終67例結核性胸膜炎患者中共有53例納入本項研究(7例隨訪流失，5例臨床診斷患者修正為其他疾病，2例患者追問病史接受過抗結核治療)，為結核組，其中男31例，女22例；年齡(38.3±7.8)歲，年齡范圍為19～65歲。結核組中確診病例30例，包括胸腔鏡病理活檢明確結核12例，胸腔積液結核菌培養陽性8例，胸腔積液結核菌核酸檢測陽性12例；臨床診斷23例。共49例惡性胸腔積液患者納入本項研究，為惡性組，其中男29例，女20例；年齡(62.5±10.3)歲，年齡范圍為46～78歲。以50名體檢中心健康體檢人員為健康對照組，其中男23名，女27名；年齡(59.3±5.3)歲，年齡范圍為52～68歲。所有患者未接受過抗腫瘤治療、免疫治療或抗結核治療，未使用過糖皮質激素或免疫抑制劑或非甾體抗炎藥。本研究通過無錫市第五人民醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.1.2 診斷標準 結核組入選標準依據2017年《中華人民共和國衛生行業標準-肺結核診斷》[3]。結核性胸膜炎確診標準:(1)胸膜病理檢查支持結核；(2)胸腔積液抗酸桿菌陽性2次；(3)胸腔積液抗酸桿菌陽性1次，結核分枝桿菌培養陽性1次；(4)胸腔積液結核分枝桿菌核酸檢測陽性。結核性胸膜炎臨床診斷標準:(1)胸腔積液為滲出液，腺苷脫氨酶升高，同時γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)釋放試驗陽性；(2)胸腔積液為滲出液，腺苷脫氨酶升高，同時PPD中度陽性或強陽性；(3)胸腔積液為滲出液，腺苷脫氨酶升高，同時結核分枝桿菌抗體陽性。

惡性組入選標準:在胸腔積液細胞沉淀中找到惡性細胞，或在胸膜活檢組織中觀察到惡性腫瘤的病理變化[4]。

健康對照組入選標準:無錫市第五人民醫院體檢中心參加健康體檢的人員(年齡≥18歲)，常規體檢結果均正常。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要的試劑和儀器 IL-27酶聯免疫吸附試驗試劑盒(美國Bio Legend公司)；酶標儀(美國Biokit公司)；低溫高速離心機、HERAcell 150i二氧化碳培養箱(美國Thermo Fisher公司)；ELx-800型全自動酶標分析儀(美國biokit公司)；FC500型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)；Th1/Th2細胞因子檢測試劑盒(美國BD公司)。

1.2.2 標本收集 入院24 h內采集結核組及惡性組患者空腹外周靜脈血20 ml，留取健康對照者的體檢殘余血5 ml，存于肝素抗凝管中。采用標準的胸腔穿刺術采集結核組及惡性組患者胸腔積液并用肝素抗凝。所有標本均經離心半徑為16 cm，2 000 r/min離心5 min，取上清液置于-80℃冰箱凍存。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗檢測 將50 ml的20×洗滌液溶于950 ml的蒸餾水里作為緩沖液。將2.06 ml的緩沖液加入到凍干的人類IL-27標準品瓶里，放于振蕩器上混勻。用緩沖液將標準品儲備液倍比稀釋為16μg/L、8μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L、500 ng/L、250 ng/L。用1×洗滌液洗板，每次洗板將1×洗滌液浸泡96孔板30 s。每孔加入50μl的緩沖液。每孔加入50μl的標準品溶液或標本。用封板模封板，在搖床上搖10 min后放于室溫孵育110 min。然后倒掉孔內溶液后洗板4次。每孔加入100μl的IL-27檢測抗體然后用封板模封板，搖床上搖10 min后放于室溫孵育50 min。然后倒掉孔內溶液后洗滌液洗板4次。每孔加入100μl辣根過氧化物酶標記的檢測液體，避光放于37℃溫箱內孵育，40 min后除空白對照孔外其余孔都變藍。每孔加入100μl的終止液終止反應，輕敲混勻。在30 min內，在酶標儀450 nm下讀吸光度值。用Curve Expert 1.3 Setup繪制標準曲線，得出相應的濃度(ng/L)。

1.2.4 流式細胞術檢測 將凍干的人Th1/Th2標準品轉移到15 ml錐形離心管中，并標記該管為最高濃度標準品。取出9根12 mm×75 mm流式上樣管，分別標記梯度稀釋的倍數1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。從1∶2管取300μl液體到1∶4管，吹打混勻，依此類推，直到1∶256管。確定實驗管數(包括標準品和對照管)，混合前每種捕獲微球需充分渦旋3～5 s。為保證每個實驗管都含有7種微球，每種捕獲微球需各取10μl。將混合好的捕獲微球200×g離心5 min，小心吸去上清，室溫避光孵育30 min。渦旋混勻混合好的捕獲微球，每個實驗管都加入50μl待測樣本。所有實驗管中都加入50μl人Th1/Th2 PE檢測試劑。所有實驗管室溫避光孵育3 h。每管加入1 ml洗液，200×g離心5 min，棄去上清，每管加300μl洗液，重懸微球。完成樣本數據獲取后，使用FCAP Array軟件來進行人Th1/Th2細胞因子數據分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0以及Graph pad prism 6.0軟件進行數據分析并繪制統計圖。所有數據使用Komogorov-Smirnov test檢驗變量是否服從正態性分布，符合正態分布的計量資料采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；兩組間的率比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。繪制受試者工作特征曲線，根據曲線下面積(area under curve，AUC)綜合評價診斷試驗的診斷價值。

2 結果

2.1 治療前不同性質胸腔積液及血清中IL-27的水平 結核組胸腔積液IL-27水平、IL-27胸腔積液/血清均高于惡性組(t=8.47、8.32，P值均＜0.05)。惡性組血清IL-27水平高于結核組及健康對照組，差異無統計學意義(F=2.76，P＞0.05)。結核組胸腔積液IL-27水平顯著高于其血清IL-27水平(t=11.30，P＜0.001)。見表1。

表1 3組受試者血清及胸腔積液中IL-27濃度的比較()

表1 3組受試者血清及胸腔積液中IL-27濃度的比較()

注:與健康對照組比較，a P＜0.05；與胸腔積液比較，b P＜0.05

組別 例數 血清(ng/L)胸腔積液(ng/L)胸腔積液/血清結核組 53 285.20±44.59ab 516.45±144.25 1.85±0.56惡性組 49 293.16±59.37 313.30±86.61 1.09±0.32健康對照組50 264.28±84.37統計值 F=2.76 t=8.47 t=8.32 P值 0.066 ＜0.001 0.005

2.2 不同性質胸腔積液中IL-2、IL-10、IFN-γ的基線水平 結核組胸腔積液IL-10及IFN-γ水平高于惡性組(t=3.04、9.81，P值均＜0.05)，結核組與惡性組胸腔積液IL-2水平比較，差異無統計學意義(表2)。

表2 結核組與惡性組患者胸腔積液中IL-2、IL-10、IFN-γ的比較()

表2 結核組與惡性組患者胸腔積液中IL-2、IL-10、IFN-γ的比較()

注:IFN-γ為γ-干擾素

組別 例數IL-2(ng/L)IL-10(ng/L)IFN-γ(ng/L)結核組53 28.00±8.95 398.08±19.45 704.17±169.53惡性組49 25.81±6.16 366.53±73.76 465.80±45.65 t值 1.58 3.04 9.81 P值 0.120 0.004 ＜0.001

2.3 胸腔積液IL-27、IL-10、IFN-γ以及聯合三者對結核性胸膜炎的診斷價值 胸腔積液IL-27的cut-off值 為377.3 ng/L時，約 登 指 數 最 高(0.66)，AUC為0.915，95%CI:0.862～0.969，診斷結核性胸膜炎的敏感度為88.0%，特異度為78.0%。胸腔積液IL-10的cut-off值為371.67 ng/L時，約登指數最高(0.57)，AUC為0.629，95%CI:0.506～0.751，診斷結核性胸膜炎的敏感度為87.1%，特異度為58.5%。胸腔積液IFN-γ的cut-off值為513.65 ng/L時，約登指數最高(0.71)，AUC為0.897，95%CI:0.836～0.959，診斷結核性胸膜炎的敏感度為81.1%，特異度為90.6%。診斷結核性胸膜炎的多變量受試者工作特征曲線分析顯示，胸腔積液中IL-27、IL-10及IFN-γ聯合的cut-off值為0.43時，約登指數最高(0.87)，AUC為0.983，95%CI:0.964～1.000，診斷結核性胸膜炎的敏感度為95.9%，特異度為90.6%(圖1)。

圖1 多種細胞因子診斷結核性胸腔積液的受試者工作特征曲線

3 討論

既往的研究已表明[5]，宿主感染了結核分枝桿菌后，主要產生Th1型免疫應答，分泌大量炎性因子，促炎性細胞因子、抗炎性細胞因子和趨化因子之間的相互作用和比例失衡與結核性胸膜炎的發病有關。在結核性胸膜炎患者胸腔積液中IL-10和IFN-γ可顯著增高，對結核性胸膜炎患者的輔助診斷具有較高的敏感度和特異度，而細胞因子檢測在結核感染診斷中的價值已被越來越多的臨床研究證實[6]。自IFN-γ檢測被引入臨床酶學后，已逐漸應用于臨床輔助診斷結核性胸膜炎[7]，甚至在歐美國家IFN-γ釋放試驗已被批準取代PPD法用于臨床檢測結核菌感染[8]。但也有一部分研究者認為實際情況并非如此，并對相關的文獻回顧分析發現[9]，胸腔積液IFN-γ檢測結核性胸膜炎的敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、陽性預測值、陰性預測值、診斷優勢比分別為78%、82%、3.49、0.24、85%、70%和19.04，并且認為胸腔積液IFN-γ無法區分活動性和非活動性結核，結果易受接觸活動性結核患者和結核感染等因素影響，因此其作為單獨指標在臨床診斷中意義有限，而相對來說用于排除結核感染的意義更大。同時也有研究發現IL-10可作為輔助診斷結核病的生物標記物之一。Joshi等[10]通過測定活動性肺結核患者、家庭接觸者和健康對照組血清中IL-10的濃度，發現IL-10可用于區分以上三者。

本研究結果顯示，結核組患者胸腔積液IL-27水平較惡性組增高，并且結核組患者IL-27胸腔積液/血清較惡性組亦明顯增高，推測胸腔中的IL-27不是來自外周血，而是由胸腔積液局部微環境中產生的，原因可能是結核分枝桿菌侵犯入胸膜腔導致胸膜血管通透性增加，形成以淋巴細胞為主的滲出液，誘發局部以CD4+T淋巴細胞為主的遲發型超敏反應所致[11]。活化的CD4+T淋巴細胞分泌大量IFN-γ，IFN-γ可以 誘 導Th0細 胞向Th1細胞分化，活化更多的細胞毒性T淋巴細胞和效應T細胞以殺死或抑制結核分枝桿菌。IL-27由活化的單核細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞產生，繼而可以誘導IFN-γ的產生[12]，因此我們推測結核性胸腔積液微環境中IFN-γ水平與IL-27水平呈正相關性。有文獻表明IL-27作為鑒別診斷結核性胸腔積液的參考指標得到了普遍肯定[13]，但其檢測結果在國內外眾多試驗中存在差異，分析原因可能為:(1)胸腔積液中結核分枝桿菌抗原刺激單核細胞產生IL-27呈時間-劑量依賴關系，因此結核感染的不同時期胸腔積液中產生的IL-27存在差異[14]。(2)部分試驗樣本量仍偏少，導致試驗結果差異較大。同時在本研究中也發現，惡性胸腔積液患者胸腔積液IL-27濃度高于其血清，這可能與IL-27可直接抑制部分腫瘤細胞的增殖，且其在腫瘤微環境中還具有抗血管生成作用有關[15]，但其免疫學機制尚不完全清楚，仍需進一步研究。

為進一步探索IL-27在結核性胸膜炎中的診斷價值，本研究采用受試者工作特征曲線來檢驗此指標的診斷效能，發現IL-27水平具有對結核性胸膜炎和惡性胸膜炎的鑒別診斷價值。本研究通過對多個細胞因子進行同步檢測發現，結核性胸膜炎患者胸腔積液中IL-10和IFN-γ顯著高于對照組，進一步分析顯示在結核性胸腔積液中IFN-γ的特異度最高，但敏感度差，IL-27的敏感度在三者中最高，但其特異度略低于IFN-γ，而IL-10的特異度和敏感度在三者比較中均無優勢。因此，在進行排除診斷時可以選擇特異度較高的IFN-γ，而確診時則選擇敏感度較高的IL-27，并且IL-10、IL-27和IFN-γ3種細胞因子聯合診斷的敏感度與特異度分別為95.9%和90.6%，和單獨使用IL-27檢測相比無明顯優勢，而同時檢測多個細胞因子費用則明顯增高。

鑒于胸腔積液IL-27檢測對于診斷結核性胸膜炎擁有較高的敏感度和特異度，特別是酶聯免疫吸附試驗檢測法相對流式檢測費用更低，操作程序簡單，技術要求低，可作為適宜技術向基層醫院進行推廣和普及。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突