肺癌早診呼吸分析研究現狀與臨床應用前景

陳情 孫美秀 李靜 崔文靜

1天津醫科大學腫瘤醫院心肺功能科 國家腫瘤臨床醫學研究中心 天津市 “腫瘤防治”重點實驗室 天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心300060；2中國醫學科學院&北京協和醫學院生物醫學工程研究所，天津300192

據WHO的數據顯示，全球每年約有160萬人死于肺癌。肺癌已成為全世界發病率和病死率最高的惡性腫瘤。我國是世界上肺癌患者最多的國家，每年約73萬人被確診為肺癌[1]。

臨床研究資料表明，原位癌治愈率接近100%，Ⅰ期肺癌患者的5年生存率達60%～90%，而Ⅲ期和Ⅳ期患者的5年生存率僅5%～20%，目前肺癌5年生存率僅為18%，部分原因是約75%的患者在確診時已屬肺癌中晚期[2-3]。若肺癌在早期階段被檢測出來，通過手術治療，5年生存率可達到50%～70%[4]。因此早期檢測對于肺癌患者至關重要。

目前，用于肺癌的早期診斷方法包括痰細胞學[5]、循環生物標記物[6]、CT/低劑量計算機斷層掃描[7]、MRI[8]、和胸部X射線[9]。除成本外，這些測試的輻射或者入侵性都會給患者造成一定的擔憂。最重要的是，這些測試結果尚未得到最終對病情的證明。因此開發一種無創、成本低廉的檢測方法一直是人們所追求的。

肺癌細胞具有高代謝的特點，自身可持續異常合成分泌各種特殊成分物質，最有可能釋放某些癌癥標記特征直接進入呼吸系統。在較早的呼出氣體中可以檢測到呼出的揮發性有機化合物(volatile organic compounds，VOCs)，其在體內代謝過程提供患者潛在的疾病信息[10]，因此，呼出的VOCs可作為肺癌診斷的生物標記物。

1 呼吸分析技術用于肺癌早期診斷的機理研究

機體在一些病理狀態下，呼氣中VOCs的成分會發生改變，呼氣分析通過檢測呼氣中VOCs成分的變化反映機體的病理生理狀態，但到目前為止，肺癌和呼出氣中的VOCs的關系尚未明確。Smith等[11]通過選擇性子流量管光譜測定法發現肺癌細胞株的培養液頂層空氣中測得的揮發性有機氣體乙醛在肺癌細胞株培養16 h以后開始增高，并與肺癌細胞的數量的升高成比例，說明肺癌細胞本身產生了特征性VOCs。而Poli等[12]，發現肺癌患者在進行腫瘤切除術后相關VOCs水平下降，也進一步證實了肺癌細胞本身可以產生VOCs。其他體系中的研究表明VOCs的代謝產生與細胞氧化應激相關，其中氧自由基與癌的產生密切相關。氧自由基可以導致肺損傷。當中性粒細胞進入肺并釋放氧自由基時，可引起蛋白質、多種不飽和脂肪酸及DNA等的過氧化損傷[13]。通過脂質過氧化反應，細胞膜上的多種不飽和脂肪酸分解代謝為已烷、戊烷、甲烷等烷烴類物質，這些物質在血液中溶解度極低，一部分易揮發的烷烴很快就經過氣血交換，直接經呼吸系統排出體外；細胞膜的損傷也增加了肺泡細胞對VOCs通透性。此外，在肺癌的研究中發現細胞色素P450酶與肺癌存在一定的相關性[14]，這些烷烴類物質也可通過細胞色素P450混合酶系統代謝，將其氧化成烷醇，排出體外。

因此，肺癌中特征性VOCs的代謝產生機制并非單一因素主導，而是由多因素共同參與。

2 用于肺癌早期診斷的呼吸分析技術及采樣方法

不同的研究小組使用各種各樣的取樣和檢測方法來鑒定生物標記物。呼氣分析中關于氣體的收集主要是在操作中避免氣體外漏和外界氣體的污染，最常用、最受歡迎的取樣技術是泰德拉袋，這也是美國環境保護署推薦用于VOCs檢測的取樣方法[15]。

大多數分析呼出氣體的研究使用的是氣相色譜質譜儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)和/或電子鼻。GC-MS已經在研究組中廣泛使用[16]。GC-MS是一種強大的工具，可以定性和定量地鑒定混合物中存在的每種揮發性化合物，但是需要充分準備的樣品，訓練有素的人員，并且價格昂貴[17]。固相微萃取技術通常與GCMS結合用于樣品的預濃縮和制備。電子鼻分析技術是由一系列電子化學傳感器和適當的模式識別系統組成的儀器。例如石英微天平氣體傳感器或分子改進的金納米顆粒，是基于傳感器材料的化學反應。它們可以提供高敏感度的測試結果[18-19]，相對便宜，體積較小，易于使用和攜帶，但是檢測選擇性較低，需要經常校準，不能檢測定量結果或識別呼吸中的每一種成分。

質子轉移反應質譜法是一種使用氣相水合氫離子作為離子源試劑的分析化學方法[20]。一種不需要預濃縮的技術，其檢測下限優于GC-MS，提高了敏感度，且操作簡單快速，但也因自身某些因素的限制，在應用推廣方面不及GC-MS廣泛。

除了以上的呼吸氣體檢測技術，近年來光譜技術在呼吸領域也不斷發展。與質譜技術相比，激光光譜技術不但具有高敏感度、高選擇性的優點，而且具有低成本、實時性及即時檢測的功能特點。測量到的生物標記物的光譜圖譜范圍從紫外到中紅外，而激光技術所達到的檢測極限范圍從百萬分之一到十億分之一。目前，在已確定的30多種呼吸生物標記物中，研究人員采用可調諧半導體激光吸收光譜技術[21]、光腔衰蕩光譜技術[22]以及光聲光譜技術[23]進行了人體多種呼吸生物標記物實驗。

3 呼吸分析技術用于肺癌早期診斷的標記物研究

用于呼吸分析的標準程序不一致性是獲得不同結果的主要原因，絕大多數的研究進行了病例對照的方法。與臨床診斷的患者相比，健康對照組中沒有發現肺癌的征兆，因此它們被認為是無癌的。表1根據呼吸氣體分析，按照發表年代的順序，描述了肺癌患者和健康志愿者對照分類的敏感度、特異度和準確率以及生物標記物的統計信息，肺癌的敏感度及特異度為51%～100%、13%～100%不等。但是，所有研究都沒有進行嚴格的驗證，這可能會導致檢測結果過于樂觀。

不同的文章進行了不同的多變量統計方法，例如模糊邏輯、主成分分析或神經元網絡等來確定物質的濃度。為了確認哪些物質為生物標記物，在統計數據處理的過程中，物質的濃度需要在癌癥患者和健康者對照組之間的差異顯示出來。這些濃度的極限值可以在研究的文章中找到。

4 呼吸分析技術用于肺癌早期診斷面臨的挑戰與機遇

肺癌是全世界惡性腫瘤致死的首要原因，其發病率和病死率呈不斷上升的趨勢。呼吸分析技術在肺癌診斷中的地位已經沒有爭議，但是如何能便捷地用于臨床操作，有效地進行分析以用于篩查診斷，是我們面臨的一項重大挑戰。到目前為止，所有的研究均表明肺癌患者的呼出氣體標記物尚未統一，各種研究的主要弱點是缺乏用于呼吸分析的標準化方法，這是評估所獲得的結果的相關性和可靠性的依據。例如，在上述所有的研究中，每篇文章所檢測的標記物種類不同，數量不同。此外，如前所述，獨立于各種分析技術，呼吸樣品采集和存儲的不統一都構成了其他一些主要的差異。創建標準化呼吸樣品采集和存儲方法是產生可靠結果的挑戰。此外我們還需要大量的臨床實驗研究，以確定呼吸氣體試驗在腫瘤患者中干預和改善生存率方面是否具有遠期的效果，從而真正評判其價值。

表1 呼吸分析檢測肺癌的性能以及生物標記物

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突