基于miR-34a/SIRT1軸探討奧沙拉秦鈉治療潰瘍性結腸炎的作用機制

江巧麗 朱佳杰 戴蕾 羅靈和 楊珠瑩

潰瘍性結腸炎是一種腸道疾病，病程較長，同時具有易復發甚至癌變等特點，嚴重影響患者生活質量及身心健康[1]。潰瘍性結腸炎所致的腸道炎性反應環境，會導致活性氧及活性氮含量明顯增加進而引發氧化應激反應，最終加重病變嚴重程度[2]。傳統抗結腸炎藥物5-氨基水楊酸與新型生物制劑均可提高炎癥性腸病療效，但由于潰瘍性結腸炎病因尚未完全明確，治療效果尚不理想。奧沙拉秦鈉是當前治療潰瘍性結腸炎常用的藥物，不僅效果較好，且不良反應少，已在臨床推廣用，但關于其具體作用機制及通過調控哪些信號通路發揮作用均未明確[3]。有研究表明微小RNA-34a（microRNA-34a，miR-34a）表達水平降低可緩解肝細胞氧化應激損傷并發揮保護作用[4]。相關研究報道沉默信息調節因子 1（silent information regulator 1，SIRT1）是 miR-34a靶基因，人晶狀體上皮細胞氧化應激反應中miR-34a表達水平上調并可通過下調靶基因SIRT1表達進而促進氧化應激反應發生[5]。由此猜測miR-34a/SIRT1途徑與氧化應激反應密切相關。因此，本研究通過建立潰瘍性結腸炎小鼠模型，探討奧沙拉秦鈉對潰瘍性結腸炎的治療效果及其與miR-34a/SIRT1軸在氧化應激方面的可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性小鼠80只，體重20～30g，購自浙江大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（浙）2017-0023。所有小鼠在溫度21～26℃、濕度45%～56%環境下適應性飼養3周，每天光照12h，白晝交替。

1.2 主要試劑與儀器 奧沙拉秦鈉膠囊購自天津力生物制藥股份有限公司（批號：20160218，規格：0.25g）；Lipofectamine2000（批號：170618）與 Trizol試劑（批號：170521）均購自美國Invitrogen公司；陰性轉染質粒與pHLV-U6-ZsGreen-Puro載體均購自上海吉凱基因技術有限公司；miR-34a過表達載體混合溶液由本實驗室構建并保存；2，4，6-三硝基苯磺酸 （TNBS）（批號：20161221）購自美國 Sigma公司；反轉錄與 SYBRTMGreenERTMKit試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；兔抗鼠SIRT1抗體（批號：8469）購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體（批號：20170416）購自北京博爾西科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（批號：20170312）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（批號：20170321）、髓過氧化物酶（MPO）（批號：20170411）、NO（批號：20170310）、一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）（批號：20170312）、谷胱甘肽-過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（批號：20160413）試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；IL-1β（批號：20160111）、IL-6（批號：20160216）、TNF-α（批號：20160213）、IL-8（批號：20160318）、ELISA 試劑盒均購自北京雅安達生物技術有限公司；PBS緩沖液（批號：20170412）購自上海遠慕生物科技有限公司。qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司；DS-U3型凝膠成像分析系統購自日本Nikon公司；Image-proplus 6.0分析軟件均購自美國Media Cybernetics公司；Eclipse CI型正置光學顯微鏡購自南京斯高譜儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 潰瘍性結腸炎小鼠模型建立、給藥及分組 小鼠適應性飼養5d后隨機選取10只小鼠為對照組，對其余70只小鼠采用TNBS法建立潰瘍性結腸炎小鼠模型，具體方法為小鼠禁食24h后分別注射40mg/kg戊巴比妥鈉，0.6ml TNBS溶于0.25ml乙醇溶液中，制作橡膠軟管插入小鼠肛門（深度為8cm），將上述混合液經注射器注入橡膠軟管，將小鼠倒立30s后，平放使其自然恢復。參照楊強[6]報道的實驗方法，建立潰瘍性結腸炎小鼠模型。按照隨機數字表法將造模成功的70只小鼠分為模型組、（奧沙拉秦鈉）低、中、高劑量組、陰性轉染組、miR-34a過表達組和奧沙拉秦鈉高劑量+miR-34a過表達組（HG組）7組，每組10只。奧沙拉秦鈉膠囊研磨后用100目篩過濾，與蒸餾水配制成質量濃度為50mg/ml（低）、100mg/ml（中）、150mg/ml（高）混懸奧沙拉秦鈉藥液，置于4℃冰箱保存。低、中、高劑量組分別給予227.5、455.0、682.5mg/kg奧沙拉秦鈉藥液灌胃，灌胃體積均為4.55ml/kg，奧沙拉秦鈉劑量相當于成人治療劑量1.5g/d、3.0g/d、4.5g/d的9.1倍[7]。陰性轉染組在小鼠尾部靜脈注射100μl陰性轉染質粒；模型組與對照組均在小鼠尾部注射100μl PBS；miR-34a過表達組在小鼠尾部靜脈注射100μl miR-34a過表達載體混合溶液；HG組在小鼠尾部靜脈注射100μl miR-34a過表達載體混合溶液；均連續給藥10d。對照組、模型組、低、中、高劑量組5組觀察比較奧沙拉秦鈉對小鼠結腸組織病理學和miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平的影響；對照組、模型組、高劑量組、陰性轉染組、miR-34a過表達組、HG組6組小鼠觀察比較奧沙拉秦鈉對小鼠結腸組織氧化應激水平、血清炎性因子表達水平和結腸組織中miR-34a、SIRT1表達水平的影響。

1.3.2 結腸組織病理變化觀測 根據小鼠日常活動參照相關文獻[8]報道進行疾病活動指數（DAI）評分評定。連續給藥10d后禁食1d，于第12天處死小鼠并剪開小鼠腹腔，沿結腸與遠端回腸切取整個腸段，采用0.9%氯化鈉溶液沖洗，展開結腸組織并仔細觀察。切取病變結腸組織，約0.11g，常規固定后制備石蠟切片，采用HE染色觀察結腸組織病變，光鏡下觀察結腸組織學變化，按照組織學損傷程度進行病理評分（HI）[9]。

1.3.3 結腸組織中miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR法。給藥處理12d后，頸部脫臼處死小鼠，采集對照組、模型組、低、中、高劑量組小鼠結腸組織，液氮中研磨結腸組織，加入10μl Trizol試劑提取總RNA，反轉錄，qRT-PCR法檢測小鼠結腸組織中miR-34a、SIRT1 mRNA 表達水平。反應條件 ：95℃5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72 ℃ 30s，共 40 個循環。miR-34a以U6為內參基因，SIRT1以GAPDH為內參基因，采用 2-ΔΔCt相對定量法計算 miR-34a、SIRT1 mRNA 的相對表達量。

1.3.4 結腸組織氧化應激水平檢測 采用硝酸還原酶法。取各組小鼠凍存結腸組織，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平；硫代巴比妥酸反應產物比色法檢測MDA水平；采用硝酸還原酶法檢測NO水平；采用髓過氧化物酶檢測MPO水平；按照iNOS檢測試劑盒檢測iNOS水平；采用酶促反應計算GSH-Px水平。

1.3.5 血清炎性因子表達水平檢測 采用ELISA法。給藥處理12d時采用脫頸法處死小鼠，并采用心臟取血法采集小鼠血液樣本置于離心管內，3 000r/min離心15min，取上血清置于-80℃超低溫冰箱保存，采用ELISA法檢測各組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8表達水平。

1.3.6 結腸組織中SIRT1蛋白表達檢測 采用Western blot法。取50mg小鼠結腸組織并加入蛋白裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳反應分離蛋白，移至PDVF膜，脫脂奶粉封閉，2h后加入SIRT1一抗（稀釋比均為 1∶1 000），置于 4℃冰箱孵育過夜，次日加入二抗（稀釋比1∶10 000），ECL顯影后置于凝膠分析系統觀察蛋白條帶，采用Imageproplus6.0圖像分析系統分析蛋白條帶積分光密度值，SIRT1蛋白相對表達量=SIRT1蛋白條帶積分光密度值/GADPH條帶積分光密度值。

1.4 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t或SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組小鼠結腸組織病理變化比較 與對照組小鼠相比，模型組小鼠結腸黏膜明顯充血、水腫且結腸長度縮短；與模型組小鼠相比，奧沙拉秦鈉低、中、高劑量組結腸外觀明顯改善，見圖1。HE染色顯示對照組小鼠結腸組織黏膜完整且腺體結構均呈排列整齊，沒有出現明顯潰瘍現象；與對照組小鼠相比，模型組小鼠結腸黏膜出現缺損且腺體結構出現分離，同時出現中性粒細胞浸潤；低劑量組與模型組相似，中劑量組小鼠結腸黏膜出現一定缺損及隱窩損傷，中性粒細胞浸潤明顯減少且可見部分腺體結構；與模型組相比，高劑量組小鼠結腸組織結構與腺體結構均較為完整，僅見少量中心粒細胞浸潤，未見隱窩損傷，見圖2。與對照組相比，模型組、低、中、高劑量組小鼠DAI評分與HI評分均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組小鼠DAI評分與HI評分均明顯降低（均P＜0.05）；與高劑量組相比，低、中劑量組小鼠DAI評分與HI評分均明顯升高（均P＜0.05），見表1。

表1 5組小鼠DAI、HI評分比較（分）

圖1 5組小鼠結腸外觀圖

圖2 5組小鼠結腸組織HE染色結果比較（×200）

2.2 5 組小鼠結腸組織中miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠結腸組織中miR-34a表達水平明顯升高，SIRT1 mRNA表達水平明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，奧沙拉秦鈉低、中、高劑量組小鼠結腸組織中miR-34a表達水平均明顯降低，SIRT1 mRNA表達水平均明顯升高（均P＜0.05）；與高劑量組相比，低、中劑量組小鼠結腸組織中miR-34a表達水平均明顯升高，SIRT1 mRNA表達水平均明顯降低（均P＜0.05）。見表2。

表25組小鼠結腸組織中miR-34a、SIRT1mRNA表達水平的比較

2.3 6 組小鼠結腸組織氧化應激水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠結腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯升高，SOD、GSH-Px水平均明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，高劑量組小鼠結腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯降低，SOD、GSH-Px水平均明顯升高（均P＜0.05）；與高劑量組相比，miR-34a過表達組與HG組小鼠結腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯升高，SOD、GSH-Px水平均明顯降低（均P＜0.05）；與陰性轉染組相比，miR-34a過表達組小鼠結腸組織MDA、MPO、NO、iNOS 水平均明顯升高，SOD、GSH-Px 水平均明顯降低（均P＜0.05）。見表3。

2.4 6組小鼠血清炎性因子表達水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8 表達水平均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比，高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8表達水平均明顯降低（均P＜0.05）；與高劑量組相比，miR-34a過表達組與HG組IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8表達水平均明顯升高（均P＜0.05）；與陰性轉染組相比，miR-34a過表達組 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8表達水平均明顯升高（均P＜0.05）。見表4。

2.5 6組小鼠結腸組織中miR-34a、SIRT1 mRNA、蛋白表達水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠結腸組織中miR-34a表達水平明顯升高，SIRT1 mRNA及蛋白表達水平均明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，高劑量組小鼠結腸組織中miR-34a表達水平均明顯降低，SIRT1 mRNA及蛋白表達水平均明顯升高（均P＜0.05）；與高劑量組相比，miR-34a過表達組與HG組小鼠結腸組織中miR-34a表達水平均明顯升高，SIRT1 mRNA及蛋白表達水平均明顯降低（均P＜0.05）；與陰性轉染組相比，miR-34a過表達組miR-34a表達水平均明顯升高，SIRT1 mRNA及蛋白表達水平均明顯降低（均P＜0.05），見圖 3、表 5。

表3 6組小鼠結腸組織氧化應激水平的比較

3 討論

潰瘍性結腸炎病變部位位于直腸與結腸黏膜層，其病理學變化主要為炎癥、糜爛及潰瘍，患者臨床表現為腹瀉、腹痛及黏液膿血便等，隨著病情嚴重程度加重可能發展為結腸癌[10]。潰瘍性結腸炎病因尚未明確且臨床缺乏特異性治療方法，因而如何控制潰瘍性結腸炎進展并減少患者復發率成為當前研究難點。因此，積極尋找潰瘍性結腸炎治療藥物成為熱點研究問題。

表4 6組小鼠血清炎性因子表達水平的比較（pg/ml）

圖3 6組小鼠結腸組織中SIRT1蛋白電泳圖

表5 奧沙拉秦鈉對轉染小鼠結腸組織中miR-34a、SIRT1表達水平的影響

奧沙拉秦鈉可有效治療反復發作型潰瘍性結腸炎并可緩解患者臨床癥狀，其作用效果明顯優于柳氮磺吡啶等藥物，同時患者胃腸道不良反應發生率均明顯降低[11-12]。本研究通過建立潰瘍性結腸炎小鼠模型，采用HE染色法觀察奧沙拉秦鈉對小鼠結腸組織病理學的影響，結果顯示低、中、高劑量組DAI評分與HI評分均低于模型組并可有效改善結腸外觀充血水腫現象，說明奧沙拉秦鈉有助于減緩潰瘍性結腸炎小鼠病理癥狀并減輕腸道黏膜損傷，提示奧沙拉秦鈉可有效治療潰瘍性結腸炎，與臨床研究相似。miR-34a表達水平與氧化應激損傷程度密切相關，隨著氧化應激反應加劇miR-34a表達水平明顯升高并可加重機體氧化應激損傷[13]。機體受到氧化應激損傷時SIRT1蛋白可通過減少細胞凋亡進而發揮抗氧化應激反應功能[14]。研究發現白內障大鼠中miR-34a表達水平升高可抑制靶基因SIRT1表達并加重機體氧化應激損傷，進而促進白內障發生[15]。本研究結果顯示模型組小鼠結腸組織中miR-34a表達水平高于對照組，而SIRT1表達水平明顯降低，高劑量組小鼠結腸組織中miR-34a表達水平明顯降低，SIRT1表達水平明顯升高，說明miR-34a/SIRT1途徑參與潰瘍性結腸炎發生過程，奧沙拉秦鈉干預后可能通過降低miR-34a表達水平并上調SIRT1表達進而發揮抗氧化作用。提示奧沙拉秦鈉可有效治療潰瘍性結腸炎小鼠，其可能通過調控miR-34a/SIRT1途徑發揮作用。

潰瘍性結腸炎所致腸道炎癥損傷與氧化應激反應密切相關，活性氧自由基大量釋放或抗氧化系統功能減弱均可造成組織損傷，MDA含量越高預示潰瘍性結腸炎大鼠體內脂質過氧化程度及細胞氧化程度加重，MPO含量增加直接反映腸道炎性細胞浸潤及炎癥反應程度并可作為評估腸道炎癥嚴重程度的重要指標，同時腸道中性粒細胞及巨噬細胞均可產生誘導型iNOS進而促使NO生成量增加，NO又可進一步促進炎癥反應并造成細胞出現不同程度損傷，同時抗氧化系統中SOD與GSH-Px均具有抗氧化及抑制潰瘍性結腸炎腸組織脂質過氧化等重要作用[16-18]。本研究為了進一步探究奧沙拉秦鈉是否通過調控miR-34a/SIRT1途徑發揮作用，同時奧沙拉秦鈉高劑量對潰瘍性結腸炎的治療效果最為明顯，因而本研究構建miR-34a過表達載體并將其經注射器注入奧沙拉秦鈉高劑量小鼠中，比較分析各組小鼠結腸組織氧化應激水平，結果顯示模型組小鼠結腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯高于對照組，SOD、GSH-Px水平均明顯降低；高劑量組小鼠結腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯低于模型組、miR-34a過表達組、HG組，而SOD、GSH-Px水平均明顯升高，說明奧沙拉秦鈉可通過抑制miR-34a表達并上調SIRT1表達進而促使SOD、GSH-Px活性升高并增強潰瘍性結腸炎小鼠抗氧化系統。提示奧沙拉秦鈉可通過調控miR-34a/SIRT1途徑進而抑制潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織氧化應激反應。潰瘍性結腸炎小鼠腸組織炎癥反應加劇，其中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8等釋放量增加并可進一步誘發周圍組織損傷[19-20]。本研究結果顯示模型組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8水平均明顯高于對照組，高劑量組小鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8 水平均明顯低于模型組、miR-34a過表達組、HG組，說明奧沙拉秦鈉可降低潰瘍性結腸炎小鼠炎癥反應，其可能通過抑制miR-34a表達并間接上調SIRT1表達發揮作用。同時本研究檢測各組小鼠結腸組織miR-34a、SIRT1表達水平，結果發現模型組小鼠結腸組織中miR-34a表達水平高于對照組，SIRT1表達水平明顯降低；高劑量組miR-34a表達水平明顯低于模型組、miR-34a過表達組、HG組，而SIRT1表達水平均明顯升高，進一步證實奧沙拉秦鈉可調控miR-34a/SIRT1途徑，提示奧沙拉秦鈉可通過調控miR-34a/SIRT1途徑進而抑制潰瘍性結腸炎小鼠腸道組織炎癥反應及氧化應激反應。

綜上所述，本研究通過建立潰瘍性結腸炎小鼠模型并應用奧沙拉秦鈉治療，初步證實奧沙拉秦鈉基于miR-34a/SIRT1軸治療潰瘍性結腸炎的作用機制。進一步研究奧沙拉秦鈉基于miR-34a/SIRT1軸治療潰瘍性結腸炎的作用效點及其與其他信號通路的可能作用機制均具有重要意義。今后將從分子水平及藥代動力學角度分析奧沙拉秦鈉治療潰瘍性結腸炎的有效性。