調治天癸方對不育癥模型大鼠睪丸組織病理形態的觀察※

●袁軼峰 朱文雄 沈 磊 劉 濤 陳其華 周 興 賀菊喬

近年來，隨著人們生活水平的普遍提高，傳統的生活方式發生了較大的改變，諸如生活節奏越來越快，工作壓力、心理壓力越來越大，精神壓抑、暴飲暴食、長期熬夜等，使得男性生殖能力下降[1]，男性不育癥的發病率逐年提高[2]，精子質量越來越差，導致男性不育癥的病因日趨復雜化[3]。如何有效提高男性生殖能力，提高精子活力成為當下關注的焦點。目前，現代醫學治療不育癥的研究仍集中于人工授精、試管嬰兒等輔助生殖技術及感染、梗阻等方面，臨床尚無解決不育癥的根本辦法[4]。中藥治療不育癥歷史悠久，具有創傷小、毒副作用少、效果明顯等優點[5]。我院國家級名老中醫賀菊喬教授根據多年治療男性不育癥的臨床經驗，制定出效驗方藥——調治天癸方。通過前期研究及臨床實踐積累，發現調治天癸方能改善男性不育癥，療效確切，但具體作用機制不明確。本實驗觀察調治天癸方對不育癥模型大鼠睪丸病理組織的影響以探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物具有生育能力SPF 級健康成年雄性Wistar 大鼠72 只，1.5 月齡，體重（160～200）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK-（京）2018-2019。

1.2 藥品調治天癸方，藥由酒炙黃芪、酒炙黃精、鹽炒菟絲子、枸杞子、炒車前子、熟地黃、酒萸肉、紫河車等組成。由湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房統一提供，并由湖南中醫藥大學第一附屬醫院煎藥房統一熬制成0.16g/mL 濃度的藥液。生精膠囊，由遵義廖元和堂藥業有限公司提供，國藥準字Z20027672，規格：0.4g/粒，產品批號20170905。

1.3 主要試劑及儀器腺嘌呤、0.9%生理鹽水、波因氏固定液：購自長沙市化學試劑公司；不銹鋼三用電熱恒溫水箱，購自北京東霞科學儀器廠；隔水式恒溫培養箱，購自上海一恒科技有限公司；BA200Digital數碼三目攝像顯微攝像系統，購自麥克奧迪實業集團有限公司。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥72 只大鼠適應性飼養1 周后，按體重隨機分為6組，每組12只，即模型對照組、正常對照組、調治天癸方大劑量組、調治天癸方中劑量組、調治天癸方小劑量組、生精膠囊組。除正常對照組外，其余5組均按文獻[6]腺嘌呤改進法造模：將腺嘌呤按500mg/mL濃度配置，并加入與腺嘌呤1：10比例的阿拉伯膠助溶，以5mL/100g/d 劑量連續灌胃10天，一次性成功。造模結束后，停止腺嘌呤灌胃，開始調治天癸方灌胃治療。正常對照組與模型對照組用等量生理鹽水灌胃治療，按人與大鼠等效劑量換算[10]，調治天癸方組分別每日用大劑量組（2.24g/100g）、中劑量組（1.12g/100g）、小劑量組（0.56g/100g）天癸方灌胃。生精膠囊組每日用（0.48/100g）生精膠囊灌胃，連續灌胃48天。

2.2 標本采集實驗結束后各組雄性大鼠采用頸椎脫位處死。處死后解剖摘取雄性大鼠睪丸、附睪，觀察外觀形態并稱重。摘取所有雄性大鼠睪丸，用波音（Bouin）氏固定液固定，睪丸固定時持續灌流，石蠟包埋，HE染色[7-9]，切片、封片，進行睪組織學觀察。

3 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計分析，多組比較采用單因素方差分析，方差齊性用LSD、S-N-K 檢驗，方差不齊采用秩和檢驗。P＜0.01 為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 大鼠一般情況觀察實驗前各組大鼠活動自如、反應靈敏、狀態良好、毛色潤澤光滑。造模期間各組大鼠排尿量逐漸增加，并隨劑量加大而加重。造模后除正常對照組較實驗前無明顯改變外，其余各組均表現為不同程度的活動減少、反應遲鈍、抱團取暖、食欲減退、飲水量增加，毛色枯槁等表現；“天癸方”灌胃開始到實驗結束，正常對照組與實驗前無明顯變化，天癸方大、中、小劑量組較造模期均有所好轉，中劑量組改善最為明顯。

4.2 大鼠性腺與模型對照組相比，正常對照組、生精膠囊組、大、中、小劑量治療組的睪丸質量有顯著性差別（P＜0.01）；與正常對照組相比調治天癸方大、中、小劑量治療組睪丸質量無顯著性差別（P＞0.05）。

表1 各組大鼠睪丸、附睪重量比較（）

表1 各組大鼠睪丸、附睪重量比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.01。

4.3 大鼠睪丸組織HE染色各組大鼠睪丸組織切片，HE染色光鏡顯示：正常對照組大鼠睪丸生精上皮完整、各級生精細胞排列規則，血管豐富，生精小管腔均可見大量成熟精子，生精小管間間質無充血水腫，無炎性細胞浸潤及纖維結締組織增生（圖1A）；模型對照組睪丸生精上皮變薄、變形、部分生精小管管腔阻塞或塌陷，生精細胞排列紊亂，大部分曲細精管發生退化、變性、各級生精細胞變性，數量減少細胞間隙增大，支持細胞連接變寬，間質水腫、輪廓不清（圖1B）；生精膠囊組和調治天癸方各劑量治療組治療后（如圖1CDEF）生精小管基膜輪廓變得完整清晰，基膜基本完整，管壁厚而圓，管腔內生精細胞的層次增多，排列也趨于條狀，生精小管管腔中由精子細胞變態發育為精子的數量相對模型組大鼠顯著增多，間質細胞成群分布于生精小管之間的疏松結締組織內。

圖1 200倍鏡下各組睪丸組織

5 討論

男性不育癥在我國早有記載，其在古代被稱為“無嗣”“不男”“男子艱嗣”“無子”“絕育”等。中醫藥治療不育具有悠久的歷史，尤其對男性不育的生理特點、病因病理、辨證施治等方面都有豐富的記載[11]。但由于封建思想及失傳等歷史原因，尚未形成系統的獨立專科。近年來男性不育治療的研究集中于顯微外科及輔助生殖技術方面，在藥物治療上方興未艾。中藥治療不育有確切療效，但當前傳統醫學在此領域的理論基礎尚不完善[12-13]。調治天癸方是由國家級名老中醫賀菊喬教授根據中醫腎-天癸-腎子軸的理論，結合多年臨床實踐總結得出來的治療男性不育癥的方劑。全方由黃芪、黃精、菟絲子、枸杞子、車前子、熟地黃、山茱萸、紫河車8 味中藥組成。方中黃芪甘、溫，用于補中生氣；黃精味甘、平，健脾益氣，填精生髓；菟絲子辛甘、微溫，滋補肝腎，肝腎為生殖之本；枸杞子味甘平，補腎陰而生腎精；山茱萸理肝腎；紫河車大補元氣。諸藥調和，填精益腎，共同作用治療男性不育癥。但具體作用效果及機制尚不明確。其改善精子質量的作用機制尚不明晰，特別是對睪丸精子發生微環境等方面的研究尚不夠深入。

本實驗通過腺嘌呤法成功復制大鼠不育癥模型。并隨著腺嘌呤給藥時間延長，模型對照組大鼠與正常對照組相比明顯出現反應遲鈍、抱團取暖、小便增多，類似中醫腎陽虛的癥狀和體征。調治天癸方各組在用藥48天后，大鼠活動度、反應靈敏度均有提高，且以中劑量組改善效果最為顯著，提示調治天癸方能改善不育癥模型大鼠的一般情況。調治天癸方各劑量治療組睪丸質量均顯著增加，與模型對照組相比，存在差異顯著性（P＜0.01）。本實驗睪丸組織病理學形態觀察結果顯示：調治天癸方各組病理改變均輕于模型對照組，生精小管基膜輪廓變得完整清晰，基膜基本完整，管壁厚而圓，管腔內生精細胞的層次增多，排列也趨于條狀，生精小管管腔中由精子細胞變態發育為精子的數量相對模型組大鼠顯著增多。提示調治天癸方可增加睪丸質量、促進睪丸生精上皮的恢復、促進生殖細胞分化為成熟的精子[14]、減輕生精小管間質水腫，最終改善性腺器官的形態結構，從而改善睪丸生精功能，提高生殖能力。生精細胞、間質細胞及和支持細胞三種細胞主要維持睪丸的生理功能[15-16]。睪丸的生殖功能主要依賴于間質細胞和支持細胞輔助生精細胞生成精子。

綜上所述，調治天癸方可明顯改善不育癥大鼠的生精環境，提高其生殖功能。其機制可能為促進睪丸生精上皮的恢復[17]、促進生殖細胞分化、減輕生精小管間質水腫，并最終改善性腺器官的形態結構，為精子的成熟提供良好的環境。