外源NO緩解草地早熟禾鎘脅迫的轉錄組分析

鮮靖蘋， 王 勇， 馬暉玲*

(1. 甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅省草業工程實驗室， 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2. 新鄉學院生命科學技術學院， 河南 新鄉 453000)

一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是一種容易通過細胞膜擴散且在各種生物體中起著重要作用的簡單氣體小分子[1]。近年來，越來越多的證據表明NO參與了植物的許多關鍵生理過程，如發芽[2]、線粒體功能性[3]、引力作用[4]和花調控[5]。另一方面，NO可介導植物調節因子和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)代謝，許多試驗表明它參與信號轉導[6-7]和對植物生物和非生物脅迫的反應[8-9]。NO通過調節活性氧及激素水平，在細胞保護中發揮重要作用[10-11]，并通過誘導轉錄變化來鑒定參與不同功能過程的基因，如信號轉導、防御和細胞死亡、轉運、基本代謝以及活性氧產生和降解[11-12]。

鎘主要來源于工業過程和農業實踐，是一種非必需的、劇毒性強的重金屬，具有較長的生物半衰期，對大多數生物都是危險的。鎘很容易被植物吸收，導致毒性癥狀，如：失綠[13]、萎蔫[14]、光合作用抑制[15]、生長減少[16]、細胞死亡[17]。Cd通過誘導膜質組成的改變導致膜功能變化，同時影響與膜相關酶的活性，如H+-ATPase(質子泵)[18]，破毀光系統中的電子傳遞鏈，影響色素蛋白復合物的聚集[19]，破壞植物水分平衡，影響氣孔關閉[20-21]，影響植物對營養元素和微量元素的吸收及分配，抑制植物生長[22]。

草地早熟禾(Poapratensis)作為多年生冷季型草坪草被廣泛種植。因其繁殖、抗逆、再生等性狀優良而被用于城市綠化、運動場、高爾夫球場草坪建設。在重金屬的植物修復方面，草地早熟禾可以迅速覆蓋地面，防止重金屬通過水或風的侵蝕遷移到其他地方；不進入食物鏈，對人類健康不存在隱患；并可通過多次刈割來減少土壤的重金屬污染，基于以上優點，草坪草在重金屬的植物修復方面的作用越來越受到重視。

以往研究表明，外源NO可改善Cd脅迫對植物的毒害作用[23-24]。可能是因為其作為氧化劑清除自由基[25]，或者作為信號分子在碳水化合物代謝和細胞壁生物合成，萜類生物合成，或生長調節等方面發揮作用[26]。草地早熟禾根系發達，對鎘有良好的吸收和積累能力，在鎘污染土壤中具有潛在的植物修復功能[27]。我們前期做的預試驗也充分證明NO可緩解草地早熟禾Cd脅迫，然而，這一現象背后的確切分子機制仍不清楚。RNA-Seq技術是一個高通量的轉錄組分析平臺，可以高效、經濟地研究各種類型的基因表達，甚至對許多非模型物種也是如此[28-29]。本研究首次對Cd脅迫下的草地早熟禾NO誘導的差異表達基因(Differentially expressed genes，DEGs)進行了基于轉錄組的分析鑒定。通過數據的統計評估可知數據質量良好。并利用RNA-Seq分析揭示了與鎘脅迫相關的基因以及NO調控的相關信號通路。這些結果為深入了解草地早熟禾重金屬解毒機制提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以北京克勞沃草業技術開發公司提供的草地早熟禾”Midnight”為試驗材料，于2018年2-5月在甘肅農業大學草業學院分子生物學實驗室及溫室中進行。

1.2 試驗處理

選取顆粒飽滿，大小一致的草地早熟禾種子若干，蒸餾水過夜浸泡后多次沖洗直至無癟種子漂浮在水面上，70%酒精浸泡沖洗后的種子1min，20%次氯酸鈉溶液浸泡15min，滅菌水沖洗5～6次，置于濾紙上晾干，均勻撒播至填裝蛭石的育苗缽置于人工智能氣候培養箱，每天噴施蒸餾水保持充足水分，晝夜溫度為25/20℃，光周期循環16/8 h，幼苗展開3～4片葉后間苗至每缽30株均勻分布，移入盛有1/2Hoagland營養液的培養盒中，每3 d更換一次營養液。

在60天的生長期后，進行試驗處理，所有處理濃度和時間均在前期預實驗的基礎上進行。以鎘離子濃度為1 000 μmol·L-1的CdCl2·2.5 H2O溶液模擬鎘脅迫。以濃度為50 μmol·L-1硝普鈉(Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O)作為NO供體，設置4個處理CK(1/2Hoagland營養液+葉面噴施蒸餾水)、Cd(1/2Hoagland營養液+1 000 μmol·L-1Cd +葉面噴施蒸餾水)、NO(1/2Hoagland營養液+葉面噴施硝普鈉)、Cd +NO(1/2Hoagland營養液+1 000 μmol·L-1Cd +葉面噴施硝普鈉)。每個處理3個重復。在處理后24 h后收集葉片樣本，冷凍在液氮中，保存在-80℃準備送樣測序。

1.3 mRNA高通量測序

使用TRIzol Reagent(Invitogen)試劑盒提取每個樣品的總RNA。并通過Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)、NanoDrop(Thermo Fisher Scientific Inc.)進行定量和鑒定。用1μg RIN值大于7的RNA進行后續文庫的制備。根據(NEBNext?UltraTMLibrary Prep Kit for Illumina?)的方法構建下一代測序文庫。使用Ribo-ZeroTMrRNA去除試劑盒(Illumina)進行Poly(A)mRNA分離。NEBNext第一鏈合成反應緩沖液和NEBNext隨機引物進行mRNA的裂解和引物處理。用ProtoScript II逆轉錄酶合成第一鏈cDNA，用第二鏈合成酶Mix合成第二鏈cDNA。將AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen) 純化的雙鏈cDNA用End Prep酶混合處理以修復兩端并在一個反應中添加dA-拖尾，然后進行T-A連接，在兩端添加適配器。每個樣本使用P5和P7引物進行11個循環PCR擴增。用AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)對PCR產物進行純化，Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)進行驗證，并利用Qubit 2.0熒光儀(Invitogen，Carlsbad，CA，USA)定量。用Illumina HiSeqTM2000對RNA樣品進行轉錄組測序。

1.4 數據分析

1.4.1質量控制： 為了去除技術序列，包括適配體、聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物或其片段，以及低于20的堿基質量，FASTQ格式數據被CutAdapter[30](版本1.9.1)過濾為高質量的干凈數據。

1.4.2程序： Trinity[31]組裝是一種從RNA-seq數據中高效地從頭開始重建轉錄本的新方法。Trinity組合了三個獨立的軟件模塊：inchWorm，Chrysalis和Butterfly，依次應用于處理大量RNA-seq讀取。其次，通過CD-HIT去除重復重疊群[32]，得到Unigene序列文件。

1.5 表達分析

以Unigene序列文件作為參考基因文件，RSEM[33](v1.2.6)從對端清潔數據估計基因和異構體的表達水平。

1.5.1差異表達基因分析 差異表達分析使用DESeq[34]Bioconductor Package，基于負二項分布模型。經Benjamini和Hochberg控制錯誤發現率方法調整后，將基因的P值設置為小于0.05以檢測差異表達基因。

1.5.2GO和KEGG富集分析 使用Go-TermFinder識別基因本體論(GO)術語，這些術語注釋了一系列p值顯著小于0.05的富集基因。

京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)是處理基因組、生物途徑、疾病、藥物和化學物質(http://en.wikipedia.org/wiki/KEGG).)數據庫集合。在內部使用腳本來豐富KEGG通路中的顯著差異表達基因。

1.6 注釋

使用BLAST軟件注釋Unigene序列。所有數據庫包括Nr，COG，Swissprot，KEGG，GO。

1.7 實時熒光定量PCR分析

隨機選取11個差異表達基因進行實時熒光定量(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)分析，對高通量數據進行驗證。用HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR試劑盒反轉錄合成cDNA，設計引物(表1) 進行qRT-PCR實驗，Actin基因作為內參。各個處理均做3次重復，采用2-△△CT方法[35]。計算基因的相對表達量。

表1 實時定量PCR選用基因及其引物Table 1 Genes and its primers for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 測序結果的評估及組裝

測序得到的對照及各處理組的Raw Reads都在4 313萬條以上。經Trinity組裝，得到的Unigene總數為478 702，平均長度為630.03 bp，N50長度為884 bp，如表2所示，組裝所得片段有很高的組裝完整性，組裝所得序列長，測序質量好。

表2 測序數據輸出質量情況Table 2 Sequencing data quality evaluation

2.2 Unigene的功能注釋

分別基于Nr，COG，SwissProt和KEGG數據庫作總Unigene注釋，結果如表3。4個數據庫可注釋的Unigene數目為275 708，占總Unigene數目的57.59%。269 494注釋到NR文庫中，占總Unigene的56.3%。在COG，Swissprot和KEGG文庫中，分別注釋了117 849，155 509和54 251個基因，分別占總Unigene的24.6%，32.5% 和11.3%。Unigene可注釋到不同物種的數量由高到底依次為二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)，數量為71 581條,占總Unigene的15.0%；其次為大麥(Hordeumvulgaresubsp.vulgare)和節節麥(Aegilopstauschii)數量分別48 606條和42 438條，分別占總Unigene的10.2%和8.9%。

表3 Unigene在各大數據庫中的功能注釋分布百分比Table 3 Percent distribution of Unigene functional annotation according to the major databases

2.3 差異表達基因分析

如表4所示，與CK對照組相比，Cd處理組共有8 055條差異表達基因(differentially expressed genes，DEG)，其中7 022條DEG上調表達，1 033條DEG下調表達。與CK對照組相比，NO處理組共有9 609條差異表達基因，其中7 463條DEG上調表達，2 146條DEG下調表達。Cd與Cd+NO處理組進行比較，共有2 584條差異表達基因，其中466條DEG上調表達，2 118條DEG下調表達。從DEG分析來看，雖然鎘脅迫導致DEG增多，但NO處理引起基因表達的改變，因此,識別這些基因成為了重點。

表4 草地早熟禾轉錄組對NO和Cd脅迫響應的差異表達基因分析Table 4 Comparisons of differentially expressed genes (DEGs) in Kentucky bluegrass with NO and Cd treatment

2.4 差異表達基因的GO分析

GO分析得到的DEGs功能注釋如表5。將Cd處理組和對照組、NO處理組和對照組的DEGs功能注釋分別進行比較，可將8 055和9 609 DEGs分別注釋到9 166和10 515個功能組。NO處理組與Cd + NO處理組的DEGs功能注釋比較，可將2 482個DEGs注釋到2 629個功能組。為了探索NO對于鎘脅迫的緩解作用，重點進行Cd處理組和Cd +NO處理組比較的GO富集分析,我們發現共有2 584個DEGs被注釋到3 199個功能組，這些功能組分別屬于生物過程(biological process)、分子功能(molecular function) 和細胞成分(cellular component)。生物過程范疇內，基因分為代謝過程的響應(945,84.4%)、有機物代謝過程(685,61.2%)、初級代謝過程(639,57.1%)、單體代謝過程(489,43.7%)、碳水化合物代謝過程(214,19.1%)和小分子代謝過程(215,19.2%)等。在細胞成分聚類中，主要有細胞(549,72.0%)、細胞部分(549,72.0%)、細胞質(417,54.7%)、細胞內細胞器(423,55.4%)、細胞膜(372,48.8%)和細胞內膜結合細胞器(366,48.0%)等作為DEGs突出的代表。分子功能聚類中，注釋最多的是催化活性(1107,84.1%)，其次是離子結合(517,39.3%)、轉移酶活性(396,30.1%)、水解酶活性(373,28.3%)、金屬離子結合(321,24.4%)、陽離子結合(324,24.6%)以及氧化還原酶活性(257,19.5%)。

表5 差異表達基因本體分析Table 5 Gene ontology analysis of DEGs

2.5 差異表達基因的KEGG富集分析

KEGG分析表明，DEGs可分為140條KEGG通路。主要富集途徑包括激素信號轉導、代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、氨基酸生物合成和氮代謝。同時,44個通路被發現與重金屬運輸和細胞解毒有關,包括MAPK信號通路,氨基酸生物合成、碳水化合物轉運與代謝、植物激素信號轉導、半胱氨酸(Cyst)和蛋氨酸(Met)代謝、苯丙烷生物合成、氮代謝、過氧化物酶體和ABC轉運蛋白等。

2.6 實時熒光定量PCR驗證

隨機選取11個差異表達基因，其中含有2個上調表達的差異基因(R-CK-TRINITY_DN124167_c0_g1_i1、M-Cd-NO-TRINITY_DN117299_c1_g2_i2)和9個下調表達的差異基因(M-NO-TRINITY_DN121243_c0_g2_i1，R-Cd-NO-TRINITY_DN142597_c2_g1_i1，R-Cd-TRINITY_DN137640_c1_g7_i2，M-CK-TRINITY_DN128501_c1_g19_i1，R-Cd-NO-TRINITY_DN144383_c1_g1_i4，M-CK-TRINITY_DN132271_c0_g5_i2，M-Cd-NO-TRINITY_DN125255_c1_g10_i5，R-Cd-NO-TRINITY_DN133509_c1_g4_i4，M-Cd-TRINITY_DN124248_c0_g4_i1)，以Actin為內參進行qRT-PCR驗證。由圖3可知，11個基因的表達趨勢與高通量測序結果基本一致，表明測序結果有效可靠。

3 討論

本研究中，通過COG功能分析對Cd+NO處理組和Cd處理組進行對比，發現差異基因富集在碳水化合物轉運和代謝、信號轉導機制、翻譯后修飾、分子伴侶、蛋白質周轉、脂質轉運和代謝、無機離子轉運和代謝、氨基酸轉運和代謝等方面。因此，NO誘導的轉錄及代謝調節從多方面響應鎘脅迫。Cd脅迫導致的差異基因表達和調控由特定信號轉導級聯引起，例如：活性氧、NO信號、鈣離子信號等，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯參與環境脅迫響應，包括MAPKKK，MAPKK，MAPK三種激酶，它們通過磷酸化及去磷酸化被激活后參與調控基因表達并引起植物對發育及環境的刺激反應[36]。在紫花苜蓿幼苗中報道了這種由Cd脅迫誘導的MAPK激活，其中Cd脅迫導致四種不同的MAPK激活：MMK2，MMK3，SIMK和SAMK[37]。本研究中158條差異基因富集在信號轉導機制方面，MAPK級聯反應中的18條基因參與調節SAPK4(gi|961441516|ref|NP_001304812.1|)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SRK2(gi|942539948|gb|ALL27273.1|)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(gi|475503964|gb|EMT04589.1|)等酶活性。NO信號介導的信號級聯是植物傳遞Cd脅迫信號的主要方式，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶可通過磷酸化作用傳遞這種信息，在Cd脅迫信號轉導中具有重要意義[38]，因此被篩選為候選基因。細胞壁中果膠、多糖及某些特定的蛋白質等可為結合重金屬提供交換位點，阻止重金屬進入原生質體[39]，細胞壁對鎘的富集作用多見報道。152條差異基因與碳水化合物轉運和代謝相關，13條基因參與編碼UDP葡萄糖-6-脫氫酶(gi|475592099|gb|EMT21987.1|)，鑒于碳水化合物代謝在Cd解毒中的重要作用，而UDP葡萄糖-6-脫氫酶(gi|475592099|gb|EMT21987.1|)是碳水化合物代謝中的關鍵酶，因此被篩選為候選基因。這些數據表明，外源NO誘導草地早熟禾糖代謝及信號轉導是其適應鎘脅迫的策略之一。

圖1 差異表達基因的GO功能分類Fig.1 GO functional classification of DEGs

圖2 差異表達基因KEGG富集分析Fig.2 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

圖3 差異表達基因的qRT-PCR驗證Fig.3 Validation of DEGs data by qRT-PCR

半胱氨酸生物合成是硫酸鹽同化途徑的最后一步，半胱氨酸在植物逆境反應中起著重要作用，是合成谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的前體分子，GSH是主要的非蛋白硫醇[40]，參與植物對重金屬的解毒過程，是植物螯合素(Phytochelatins，PCs)合成前體，PCs可與有毒重金屬離子結合，這些配合物通過ABC型轉運體運輸到液泡中[41]。谷氨酸在植物氨基酸代謝中占有中心地位，其碳骨架和α-氨基可合成γ-氨基丁酸、精氨酸和脯氨酸，精氨酸可與Cd形成配位體而降低毒害，同時，谷氨酸也是谷氨酰胺合成前體物質，而谷氨酰胺是木質部汁液運輸的主要氨基酸[42-43]。甲硫氨酸是主要的含硫氨基酸，可以和Cd2+形成穩定螯合物[44]。通過KEGG通路分析，將Cd+NO處理組和Cd處理組進行對比發現，共有122條差異基因富集在氨基酸生物合成代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、苯丙氨酸代謝3條通路上，編碼5-甲基四氫丙酰基谷氨酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶(EC:2.1.1.14)、谷氨酰胺合成酶(EC:6.3.1.2)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC:2.5.1.6)、蛋氨酸-γ-裂合酶(EC:4.4.1.11)的基因參與表達，這些結果表明，氨基酸合成與代謝可能參與了NO對草地早熟禾Cd脅迫的解毒過程。由于5-甲基四氫丙酰基谷氨酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶(EC:2.1.1.14)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC:2.5.1.6)、蛋氨酸-γ-裂合酶(EC:4.4.1.11)是半胱氨酸和甲硫氨酸合成的關鍵酶，因此被篩選為與Cd解毒相關候選基因。谷氨酰胺合成酶(EC:6.3.1.2)直接影響谷氨酰胺合成，從而影響木質部中重金屬離子轉運，對于中毒植物解毒具有重要意義[43]，因此被篩選為與Cd解毒相關候選基因。

細胞壁對Cd封存防止其進入細胞，是植物防御Cd脅迫的策略之一[45]。Cd誘導細胞壁過氧化物酶活性增強細胞壁木質化[46-47]，與此同時，Cd脅迫誘導氧化爆發產生ROS，其中信號分子過氧化氫再次觸發編碼過氧化物酶的基因表達，加重木質化，抑制植物生長[39]。木質素由單木脂醇(即正香醇、芥子醇和松木醇)組成，其生物合成需要一系列酶參與[48-49]。KEGG通路分析發現，鎘處理下添加NO與單獨鎘處理相比，有139條差異基因富集在苯丙烷生物合成通路上，77條參與基因編碼過氧化物酶(EC:1.11.1.7)，誘導木質化，鑒于過氧化物酶(EC:1.11.1.7)的高表達及解毒功能，因此可以篩選為NO介導的與Cd解毒相關的候選基因。同時，苯丙氨酸氨裂解酶(EC:4.3.1.24)、咖啡酸3-O-甲基轉移酶(EC:2.1.1.68)、莽草酸O-羥基肉桂酰轉移酶(EC:2.3.1.133)和肉桂醇脫氫酶(EC:1.1.1.195)也參與愈創木質木質素、紫丁香木質素、對羥基苯基木質素等一系列產物合成，因此，NO誘導的早熟禾木質化可能是其抵御鎘脅迫的重要機制。

4 結論

本研究基于轉錄組測序分析，初步揭示外源NO緩解草地早熟禾鎘脅迫的分子機制。研究發現外源NO主要影響氨基酸生物合成、苯丙烷生物合成和信號轉導相關的基因，如谷氨酰胺合成酶、谷氨酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸-γ-裂合酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶和過氧化物酶等基因，抵御鎘脅迫對草地早熟禾的毒害作用。同時，外源NO誘導的碳水化合物轉運與代謝也參與了植物對鎘的螯合，減輕鎘脅迫對植物造成的不利影響。本文所鑒定的DEGs可用于分子標記或進一步研究外源NO對鎘脅迫調節的功能分析。