小鼠海馬神經細胞的分離培養

劉青青

摘 要 在發育生物學和神經生物學研究領域，小鼠原代海馬神經細胞都是極為重要的細胞材料。它可用于關鍵基因及蛋白表達分析、線粒體功能及電生理研究，為神經系統的發育及相關疾病的發生發展提供理論依據。本研究旨在建立一種高效穩定的小鼠海馬神經細胞的分離和培養方法。

關鍵詞 海馬神經細胞 原代細胞培養 C57BL/6J小鼠

中圖分類號：R394.2文獻標識碼：A

體外培養的神經細胞具有不受體內因素干擾，易于觀察和造模等優點，目前被廣泛應用于神經退行性疾病、缺血性腦血管疾病等神經系統相關疾病的研究。海馬神經細胞包含了神經細胞的大部分類型，體外培養過程中能形成廣泛的樹突連接。分離提取小鼠海馬神經細胞不僅能達到較高的細胞純度，且神經細胞具有較高的一致性。但是由于神經細胞是高度分化的細胞，體外培養生長緩慢且不能傳代，因此掌握一種高效穩定地分離培養原代海馬神經細胞的方法尤為重要。本研究提供了一種分離培養海馬神經細胞的方法，該方法可重復性好，獲取的神經細胞生長及突觸延展狀態良好。

1材料與方法

1.1材料與儀器

小鼠腦切片模具、剃須刀片、眼用手術剪和鑷子、離心管、細胞培養皿、1mL和5mL無菌注射器、臺式離心機、顯微鏡、體視顯微鏡、超純水機、高壓滅菌鍋、pH計、細胞培養箱

1.2試劑

Neurobasal medium（NBM）、B27 supplement（50祝MEM/F12、FBS、PBS、100姿埂？.22 m過濾器購自Thermo Fisher Scientific;Papain、Trypsin inhibitor、poly-D-lysine（PDL）、2-Amino-5-phosphonopentanoic acid（APV）、BSA、L-Cysteine、D-glucose、Sucrose、Hepes購自Sigma公司; NaOH、NaCI、KCI、Na2HPO4、KH2PO4購自國藥化學試劑公司。

1.3實驗動物

SPF級的C57BL/6J雌雄鼠購自南京大學模式動物中心，飼養于蘇州大學實驗動物中心SPF屏障系統。動物實驗操作嚴格遵守蘇州大學實驗動物倫理委員會的要求。

2方法

2.1溶液配制

2.1.1 PDL配制及培養皿包被

滅菌的ddH2O溶解適量PDL，配制成0.1mg/mL的工作濃度。取1mL加入到35mm的細胞培養皿中，培養皿放置到細胞培養箱中孵育過夜。第二天吸棄未聚合的PDL，用PBS洗2次，即可接種細胞。

2.1.2解剖液

分別稱取8g的NaCI，0.4g的KCI，0.024g 的Na2HPO4，0.03g的KH2PO4，2.35g的Hepes，6g的D-glucose和15g的Sucrose，加入700mL的ddH2O溶解后，使用1mol/L的NaOH調節溶液pH為7.4，然后定容至1L，高壓滅菌后備用。

2.1.3 Papain酶消化液

分別取出50units的Papain，100 L的3mg/mL的L-Cysteine，50 L的5mM的APV，7 L的0.1mol/L的NaOH加到15mL的離心管中，用解剖液補足至5mL，該管記為Tube1。

2.1.4 BSA/ Trypsin inhibitor緩沖液

分別稱取1g的BSA，1g的Trypsin inhibitor，加入7mL的解剖液攪拌溶解后，用1mol/L的NaOH調節溶液pH為7.4，定容至10mL，0.22 m濾器除菌后備用。

2.1.5 高濃度Trypsin抑制液

吸取3mL的解剖液，0.3mL的BSA/ Trypsin inhibitor緩沖液，30 L的5mM的APV放置到15mL離心管內混合均勻，均分到2個離心管內，分別記為Tube2和Tube3。

2.1.6低濃度Trypsin抑制液

吸取9mL的解剖液，90 L的BSA/ Trypsin inhibitor緩沖液，90 L的5mM的APV放置到15mL離心管內混合均勻，均分到3個離心管內，分別記為Tube4、Tube5和Tube6。

2.1.7細胞接種培養基

10%FBS+1%雙抗+89%DMEM/F12。

2.1.8海馬神經細胞培養基

10mL的B27（50祝┘尤氳？00mL的NBM中，混合即成。

2.2原代海馬神經細胞制備

（1）性成熟的C57BL/6J雌雄小鼠按照2：1比例合籠配種。

（2）實驗當天，將解剖液、腦切片模具、Tube1-6置于冰上備用。

（3）取胎鼠或者出生1-3天的小鼠，用酒精棉球擦拭鼠體表面除菌。

（4）剪下小鼠頭部，去除頭部皮膚和腦部肌肉，暴露頭骨。

（5）輕輕地剪開軟頭骨，去除腦膜和血管后用彎鑷取出完整的腦組織放到含有預冷解剖液的腦切片模具上。以下操作均在冰浴條件下進行，動作要迅速。

（6）用剃須刀片沿著腦部冠狀軸切片，切成多片1mm寬的腦片。然后用1mL注射器針頭將腦片轉移到含有解剖液的培養皿中。

（7）體視顯微鏡下邊觀察邊用針頭去除腦片的其他組織，僅留海馬區。

（8）將海馬區組織轉移到35mm培養皿中，加入Tube1中的Papain酶消化液，置于培養箱內消化30min，每10min取出用移液槍輕輕吹勻。

（9）將組織塊轉移到10mL的解剖液中，靜置1min。

（10）組織塊吸出轉移到Tube2中，靜置2-3min。

（11）按照上步操作，將組織塊依次轉移到Tube3-6中，每個Tube中均靜置2-3min。

（12）吸出組織團加入到含有3mL的細胞接種培養基的離心管中，輕輕吹打組織團，組織團變散直至消失。

（13）細胞接種到PDL包被的培養皿中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養過夜。

（14）細胞培養2d后，換液，培養基更換為海馬神經細胞培養基。

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