抗體偶聯藥物抗CD30-MCC-DM1的制劑處方研究

張恒賓，徐珺，曹雪梅，張一帆，吳勁松，楊彤，沈毅珺

論著

抗體偶聯藥物抗CD30-MCC-DM1的制劑處方研究

張恒賓，徐珺，曹雪梅，張一帆，吳勁松，楊彤，沈毅珺

篩選并確定新型抗體偶聯藥物抗 CD30-MCC-DM1（F0002-ADC）的制劑處方，解決該藥溶解度偏低、凍干制劑含水量較高等問題，進而得到適用于該藥物的制劑處方。

對緩沖鹽、pH 值、蛋白保護劑以及助溶劑等條件或參數設計實驗進行考察。

得到了蛋白濃度5 g/L、pH5.0、緩沖鹽枸櫞酸濃度10 mmol/L、蛋白保護劑蔗糖濃度6%（w/v）、表面活性劑聚山梨酯 20 濃度0.02%（w/v）以及助溶劑鹽酸精氨酸濃度3%（w/v）的制劑處方，制得的凍干制劑含水量低于 3%。

該制劑配方能提高藥物溶解度、降低凍干制劑含水量，并通過長期穩定性實驗驗證了該配方能滿足 F0002-ADC 的臨床需求。

抗體偶聯藥物； CD30； 制劑處方； 精氨酸鹽酸鹽

通過抗體偶聯藥物（antibody-drug conjugate，ADC），Paul Ehrlich 的魔彈理論正在變成現實[1]。典型的 ADC 是由連接子將單克隆抗體和細胞毒素偶聯起來的復合物[2]，同時具有抗體的靶向性和小分子化藥的高效殺傷性，是免疫治療和化療的完美結合。ADC 通過靜脈注射進入體內，在單克隆抗體的靶向作用下，運輸至腫瘤細胞并被吞噬進入溶酶體，連接子在此被酶切或降解，最終釋放細胞毒素殺傷腫瘤細胞[3]。

注射用重組人鼠嵌合抗 CD30 單克隆抗體-MCC-DM1 偶聯劑（F0002-ADC）是上海復旦張江生物醫藥股份有限公司和上海交聯藥物研發有限公司共同開發的創新偶聯藥物新藥，目前已進入臨床階段（臨床申請號：NCT03894150）。

F0002-ADC 結構為：F0002 單抗、酶不可降解連接子 SMCC 以及高活性的微管蛋白抑制劑 DM1（圖 1）。F0002-ADC 可特異性殺傷 CD30 陽性腫瘤細胞，并且由于其釋放的小分子不具有“旁觀者效應”，可避免對正常細胞的傷害[4]。

圖1 F0002-ADC 結構示意圖

Figure 1 General view of F0002-ADC

ADC 藥物制劑處方的開發與傳統抗體藥物類似，但是抗體-小分子偶聯的形式會引入新的質量屬性[5]，因此在制劑處方的選擇過程中需要兼顧單克隆抗體與小分子兩者的性質。首先，ADC 的主體框架為單克隆抗體，因此在制劑研究過程中需要考慮單抗的穩定性；其次，還要充分考慮到小分子藥物對整個 ADC 理化性質的影響。例如，由于偶聯的細胞毒素通常為強疏水性小分子[6]，易導致 ADC 藥物整體的可溶性降低，直接影響藥物特性。

F0002-ADC 在工藝開發過程中就遭遇類似問題：F0002-ADC 樣品在稍高濃度（> 5 mg/ml）即出現乳白色絮狀不溶物，溶解性較差。為提高溶解性，最終選擇添加助溶劑，并通過優化凍干工藝消除了助溶劑對凍干粉餅外形的影響。

F0002-ADC 藥物的制劑處方研究主要分為三部分：制劑處方初篩、制劑處方優化以及長期穩定性評估。其中制劑處方初篩主要確定了蛋白保護劑、表面活性劑及其濃度。制劑處方優化是在初篩的基礎上確定 pH 值、緩沖鹽及其濃度、助溶劑及其濃度、蛋白保護劑濃度。最后通過長期穩定性研究評估各項理化性質及活性的變化情況來確認最終處方。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

LyoBeta 6PL 凍干機購自西班牙 Telstar 公司；Q2000 差示掃描量熱儀購自美國 TA 公司；E2695 高效液相分析系統購自美國Waters 公司；TSKgel G3000SWXL 色譜柱（5 μm，7.8 mm ×300 mm）購自日本Tosoh 公司；PA800 plus 毛細管電泳分析系統購自美國 Beckman Coulter 公司；831 KF 庫侖法卡氏水分測定儀購自瑞士 Metrohm 公司；SpectraMax m2e 多功能酶標儀為 Molecular Devices 公司產品。枸櫞酸購自湖南華日制藥有限公司；蔗糖購自默克公司；鹽酸精氨酸購自上海協和氨基酸有限公司；聚山梨酯 20 購自美國 JT Baker 公司。

1.2 方法

1.2.1 F0002-ADC 的制備 表達 F0002 單抗的 CHO 細胞復蘇后經搖瓶擴增、反應器種子擴增，進入 42 L 反應器生產。收獲的上清液經親和層析、深層過濾、陽離子交換層析及 UF/DF 超濾濃縮后制得單克隆抗體樣品。單克隆抗體與連接子 SMCC 經第一步偶聯后形成抗體-MCC 中間產物，抗體-MCC 再與細胞毒素 DM1 進行第二步偶聯形成抗體-MCC-DM1 偶聯劑，制得 F0002-ADC 樣品。

1.2.2 差示掃描量熱法（DSC）分析 樣品稀釋至 1 mg/ml，脫氣 10 min；根據 tray setup 中對應位置，分別取脫氣后供試液 400 μl 至相應 96 孔板孔內，再將 96 孔板置于樣品槽。設置樣品槽溫度 15 ℃，起始溫度 25 ℃，終止溫度 100 ℃，升溫速率 9 ℃/min。用 Proteus Analysis 軟件對數據進行分析。

1.2.3 尺寸排阻色譜法（SEC）純度分析 色譜柱：TSKgel G3000SWXL（5 μm，7.8 mm × 300 mm）；流動相：0.2 mol/L K2HPO4，0.2 mol/L KCl，15% 異丙醇，pH 5.5；流速：0.6 ml/min；上樣量：200 μg；柱溫：25 ℃；樣品池溫度：5 ℃；檢測波長：280 nm。用 Waters E2695 高效液相分析系統對實驗結果進行數據處理，用面積歸一化法計算純度。

1.2.4 毛細管電泳（CE-SDS）純度分析 用 SDS 樣品緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液，含 1% SDS，pH 9.0）將供試品稀釋至 1 mg/ml，分別吸取 95 μl 稀釋的蛋白溶液，2 μl 10 kD 內標，5 μl β-巰基乙醇，全部加入 0.5 ml 離心管中，旋渦振蕩混勻后，置于恒溫混勻儀中 70 ℃孵育 10 min，冷卻至室溫，取 100 μl，采用毛細管電泳分析系統處理樣品，帶寬：10 nm，樣品池溫度：10 ℃，毛細管溫度：25 ℃，檢測波長：220 nm。原始圖譜導入 Empower 軟件，按面積歸一化法計算。

1.2.5 含水量分析 參考《中華人民共和國藥典》2015 年版通則 0832 第一法中庫倫滴定法，以卡爾-費休氏反應為基礎，應用永停滴定法（《中華人民共和國藥典》2015 年版通則 0701）測定供試品，根據碘和二氧化硫在吡啶和甲醇溶液中與水定量反應的原理來測定水分。將供試品快速搗碎，精密稱取 20 mg 樣品加入水分測定儀中進行反應。每批測定 3 瓶供試品，每瓶測定 2 次。

1.2.6 相對結合活性分析 將 hCD30 抗原以 108 ng/ml 包被于 96 孔酶標板中，2 ~ 8 ℃靜置過夜。3% BSA 室溫封閉 2 h。將梯度稀釋的 F0002-ADC 樣品（20000 ~ 1.4 ng/ml）與生物素化 F0002 抗體等體積混勻后加入酶標板中，競爭結合hCD30 抗原，室溫下，200 r/min 轉速離心孵育1 h。以 HRP 標記的鏈霉親和素為酶聯，同上條件孵育 1 h。TMB 顯色，1 mol/L H2SO4終止。置于酶標儀 m2e 中，450 nm（檢測）/650 nm（參比）波長下進行讀數。選擇四參數擬合方式對數據進行分析。

1.2.7 生物學活性分析 用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基將 Karpas299 細胞稀釋至 5 × 104/ml，100 μl/孔種于 96 孔細胞培養板中。隨后加入梯度稀釋的 F0002-ADC 樣品（50 ~ 0.3 ng/ml）。在 37 ℃，5% CO2的培養箱中孵育 77 h 后，加入 30 μl/孔的阿爾瑪藍染料，繼續孵育 19 h。室溫混勻半小時后，置于酶標儀 m2e 中，530 nm（激發）/590 nm（發射）波長進行讀數。選擇四參數擬合曲線對結果進行數據分析。

1.2.8 助溶效果比較實驗 F0002-ADC 在開發初期遇到溶解性較差的問題，一般可以嘗試通過調整 pH、改變鹽種類/濃度、添加助溶劑等多種方式解決[7-8]。設計實驗考察了以下兩種方法：提高制劑的 pH 值和添加助溶劑鹽酸精氨酸[9]。

控制抗體濃度 10 mg/ml，將 F0002-ADC 樣品分別置換到五種不同 pH 值和鹽酸精氨酸的緩沖液中。緩沖液條件如下：① 20 mmol/L 琥珀酸鹽，3% 鹽酸精氨酸，pH 5.0；② 20 mmol/L 琥珀酸鹽，pH 5.0；③ 20 mmol/L 琥珀酸鹽，pH 5.5；④20 mmol/L 枸櫞酸鹽，pH 6.0；⑤ 20 mmol/L 枸櫞酸鹽，pH 6.5。室溫下靜置 2 h 后觀察樣品溶解性。

1.2.9 不同處方樣品的DSC 實驗 在 pH 6.0 條件下，設計不同濃度的枸櫞酸、蔗糖以及鹽酸精氨酸的配方組合，通過 DSC考察不同處方中的 ADC的 Tm值。具體緩沖液條件如下：① 25 mmol/L枸櫞酸鹽，3% 蔗糖，3% 鹽酸精氨酸，pH 6.0；② 50 mmol/L 枸櫞酸鹽，3% 蔗糖，3% 鹽酸精氨酸，pH 6.0；③ 25 mmol/L 枸櫞酸鹽，3% 蔗糖，pH 6.0；④ 25 mmol/L 枸櫞酸鹽，6% 蔗糖，3% 鹽酸精氨酸，pH 6.0；⑤ 50 mmol/L 枸櫞酸鹽，6% 蔗糖，3% 鹽酸精氨酸，pH 6.0；25 mmol/L 枸櫞酸鹽，6% 蔗糖，pH 6.0。

1.2.10 緩沖鹽濃度對凍干制劑含水量的影響實驗 控制抗體濃度 5 mg/ml，將 F0002-ADC 樣品分別置換到三種不同濃度（10、25 和 50 mmol/L）的枸櫞酸鹽緩沖液（6% 蔗糖，3% 鹽酸精氨酸，pH 5.0）中。樣品凍干后檢測含水量。

1.2.11 40 ℃加速實驗 控制抗體濃度 5 mg/ml，將 F0002-ADC 樣品放置到 pH 分別為 5.0、5.5 和 6.0 的緩沖液中。緩沖條件如下：25 mmol/L 枸櫞酸鹽，6% 蔗糖，3% 鹽酸精氨酸，0.02% 聚山梨酯 20。

分別在第 0、3、5、7、14、30 天取樣檢測 SEC-HPLC 及 CE-SDS 純度，考察在不同 pH 下凍干樣品的穩定性變化。

1.2.12 長期穩定性實驗 依據制劑處方優化結果，進行 3 批樣品生產。樣品放置于 2 ~ 8 ℃條件下，進行 24 個月的長期穩定性考察，分別在第0、3、6、9、12、15、18、21、24 個月取樣送檢。主要考察項目有 SEC、CE-SDS（還原/非還原）、含水量、生物學活性以及相對結合活性。

2 結果

2.1 助溶效果比較實驗結果

助溶結果如表 1 所示，提高制劑的 pH 值和添加助溶劑鹽酸精氨酸均能有效提高 F0002-ADC 藥物的溶解性。但是由于提高制劑 pH 值會對 ADC 藥物的穩定性產生較大的風險。因此在配方中添加 3% 的鹽酸精氨酸成為提高溶解性的首選。

表 1 助溶效果比較

2.2 不同處方樣品的 DSC 實驗結果

DSC 結果如表 2 所示，在選取的制劑處方及其參數范圍內，制劑凍干前后Tm值及差值均無明顯差異，即熱穩定性無差異。

通過 DSC 樣品含水量的分析，還發現如下趨勢：3% 鹽酸精氨酸的添加會導致含水量的增加；含水量與枸櫞酸的濃度正相關，與蔗糖濃度相關性不大。

2.3 緩沖鹽濃度對凍干制劑含水量的影響

含水量檢測結果如表 3 所示，制劑含水量與緩沖鹽濃度正相關，10 mmol/L 和 25 mmol/L 枸櫞酸濃度的配方均能滿足含水量< 3% 的藥典要求。暫定枸櫞酸濃度為 10 mmol/L，為滿足滲透壓要求，蔗糖質量濃度相應確定為 6%。

2.4 40 ℃加速實驗結果

40 ℃加速實驗結果如圖 2 所示，ADC 凍干制品的純度在 pH 5.0、5.5、6.0 下均較穩定；相對結合活性在 79% ~ 88% 之間，無明顯差異。

表 2 不同制劑配方下 DSC 及含水量結果

表 3 不同枸櫞酸濃度下凍干樣品水含量的測定

圖 2 凍干制劑純度比較（A：凍干樣品 SEC 純度；B：凍干樣品 CE-SDS 純度）

Figure 2 Purity compare of freeze-drying cakes (A: SEC-HPLC result of freeze-drying sample; B: CE-SDS result of freeze-drying sample)

2.5 長期穩定性實驗結果

長期穩定性檢測結果如圖 3 所示，F0002-ADC 成品經過長期考察，各指標均無明顯變化，符合 F0002-ADC 成品質量標準。

3 討論

一個典型的制劑配方，除主藥外，還應該包含：pH 緩沖鹽、蛋白保護劑、表面活性劑以及助溶劑等組分[10]。通常在凍干制品中會加入蛋白保護劑以幫助蛋白在凍干過程中保持穩定。常用的蛋白保護劑有糖類、醇類、特定的氨基酸等。在單抗制劑中，蔗糖作為非還原性糖被廣泛應用[11]，結合部分已上市ADC 藥物的處方，F0002-ADC 選擇蔗糖作為蛋白保護劑。表面活性劑的加入能減少蛋白變性，阻止聚體及微粒的形成，抗體類藥物和 ADC 常用的表面活性劑有聚山梨酯 20 和聚山梨酯 80[12]。本課題中，由于 F0002-ADC 與 Kadcyla 具有相同的連接子和細胞毒素，所以直接采用相同的表面活性劑（0.02% 聚山梨酯 20）。

制劑處方的 pH 值是制劑穩定性的重要影響因素，選擇 pH 值的范圍要考慮主藥的理化性質，不恰當的 pH 值會造成抗體質量下降，主要表現在聚體含量增加、抗體的溶解性差異、氧化及脫酰胺化等方面[13]。由氨基酸組成的生物大分子的 pH 值穩定范圍通常在5.0 ~ 7.0 之間，參考已批準上市的 20 多種抗體制劑配方，pH 值選擇范圍在 6.3 ± 0.6 之間[14]，結合已上市 ADC 藥物的制劑處方以及 F0002-ADC 的理化性質，將 pH 值的初步考察范圍定為 5.0 ~ 6.0。枸櫞酸鹽由于具有較高的崩塌溫度，且在凍融過程中 pH 的變化范圍不大，被廣泛應用于凍干產品的制劑處方中[7-8]，根據初步選定的 pH 范圍，確定枸櫞酸作為制劑中 pH 緩沖鹽。40 ℃加速實驗結果表明，ADC 凍干制品的純度在 pH 5.0、5.5、6.0 下均較穩定；相對結合活性在 79% ~ 88% 之間，無明顯差異。另據報道，由于抗體與連接子之間酰胺鍵易產生斷裂，ADC 藥物在 pH 4.0 ~ 7.2 的范圍內都能發現游離小分子藥物[15]。且 pH 值越高，小分子藥物脫落就越迅速，最終選擇的制劑 pH 為 5.0。

圖 3 長期穩定性檢測結果（A：SEC 單體變化趨勢；B：SEC 聚體變化趨勢；C：還原 CE-SDS 單體變化趨勢；D：非還原 CE-SDS 低分子變化趨勢；E：含水量變化趨勢；F：生物學活性變化趨勢；G：相對結合活性變化趨勢）

Figure 3 Long-term stability experiment results (A: Main peak by SEC-HPLC; B: Aggregate by SEC-HPLC; C: Immunoglobuin G by CE-SDS (under reducing condition); D: Low molecular weight impurities by CE-SDS (under non-reducing condition); E: Moisture; F: Relative potency; G: Relative potency by binding assay)

F0002-ADC 與具有相同的連接子和小分子藥物 DM1。考慮到小分子藥物的穩定性，制劑配方的 pH 值確定為 5.0。

綜上，經文獻歸納及實驗研究，確定F0002-ADC制劑處方為 10 mmol/L 枸櫞酸鹽，6% 蔗糖，3% 鹽酸精氨酸，0.02% 聚山梨酯 20，pH 5.0。

依據制劑處方研究結果進行的 3 批次 24 個月長期穩定性考察，結果表明，F0002-ADC 成品各指標均無明顯變化，符合 F0002-ADC 成品質量標準。表明本品在長期條件下穩定性良好，該制劑處方能夠保證主藥穩定有效。

F0002-ADC 制劑處方開發過程中，面臨的最大問題是樣品溶解度偏低以及含水量較高。最終通過添加鹽酸精氨酸解決溶解度偏低的問題；通過降低鹽濃度（10 mmol/L 枸櫞酸鹽），將最終制劑的含水量控制在 3% 以內。

在研究過程中，利用 DSC 對樣品的緩沖鹽、蛋白保護劑和助溶劑條件進行快速篩選，因為選定的條件充分參考已上市成熟的 ADC 制劑配方，Tm值并未顯示出差異性；但是通過該實驗發現了緩沖鹽濃度、助溶劑對凍干樣品含水量的影響。最終得到了 10 mmol/L 枸櫞酸鹽，6% 蔗糖，3% 鹽酸精氨酸，0.02% 聚山梨酯 20，pH 5.0 的制劑處方。然后通過長期穩定性數據最終驗證了選定制劑配方的可行性。

[1] Witkop B. Paul Ehrlich and his Magic bullets--revisited. Proc Am Philos Soc, 1999, 143(4):540-557.

[2] McCombs JR, Owen SC. Antibody drug conjugates: design and selection of linker, payload and conjugation chemistry. AAPS J, 2015, 17(2):339-351.

[3] Jain N, Smith S, Ghone S, et al. Current ADC linker chemistry. Pharm Res, 2015, 32(11):3526-3540.

[4] Shen Y, Yang T, Cao X, et al. Conjugation of DM1 to anti-CD30 antibody has potential antitumor activity in CD30-positive hematological malignancies with lower systemic toxicity. MAbs, 2019, 11(6):1149-1161.

[5] Wakankar AA, Feeney MB, Rivera J, et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjug Chem, 2010, 21(9): 1588-1595.

[6] Buecheler JW, Winzer M, Tonillo J, et al. Impact of payload hydrophobicity on the stability of antibody-drug conjugates. Mol Pharm, 2018, 15(7):2656-2664.

[7] Reddy K RC, Lilie H, Rudolph R, et al. L-Arginine increases the solubility of unfolded species of hen egg white lysozyme. Protein Sci, 2005, 14(4):929-935.

[8] Trevino SR, Scholtz JM, Pace CN. Measuring and increasing protein solubility. J Pharm Sci, 2008, 97(10):4155-4166.

[9] Inoue N, Takai E, Arakawa T, et al. Specific decrease in solution viscosity of antibodies by arginine for therapeutic formulations. Mol Pharm, 2014, 11(6):1889-1896.

[10] Ji JA, Liu J, Wang YJ. Formulation development for antibody-drug conjugates//Wang J, Shen WC, Zaro JL. Antibody-drug conjugates -- the 21st century magic bullets for cancer. New York: Springer, Cham, 2015:79-95.

[11] Carpenter JF, Crowe JH. The mechanism of cryoprotection of proteins by solutes. Cryobiology, 1988, 25(3):244-255.

[12] Kerwin BA. Polysorbates 20 and 80 used in the formulation of protein biotherapeutics: structure and degradation pathways. J Pharm Sci, 2008, 97(8):2924-2935.

[13] Usami A, Ohtsu A, Takahama S, et al. The effect of pH, hydrogen peroxide and temperature on the stability of human monoclonal antibody. J Pharm Biomed Anal, 1996, 14(8-10):1133-1140.

[14] Warne NW. Development of high concentration protein biopharmaceuticals: the use of platform approaches in formulation development. Eur J Pharm Biopharm, 2011, 78(2):208-212.

[15] Chih HW, Gikanga B, Yang Y, et al. Identification of amino acid residues responsible for the release of free drug from an antibody-drug conjugate utilizing lysine-succinimidyl ester chemistry. J Pharm Sci, 2011, 100(7):2518-2525.

Formulation study of anti-CD30-MCC-DM1

ZHANG Heng-bin, XU Jun, CAO Xue-mei, ZHANG Yi-fan, WU Jin-song, YANG Tong, SHEN Yi-jun

We aim to optimize and determine the formulation of anti-CD30-MCC-DM1 (F0002-ADC) to improve its stability and reduce the moisture of its freeze-drying sample.

Experiments were designed to investigate the parameters such as buffer salts, pH, protein protectants, and solubilizers to find the optimal formulation of F0002-ADC.

After screening, the best formulation was found to contain 5 g/L F0002-ADC, 6% (w/v) sucrose, 3% (w/v) Arg-HCl, 0.02% (w/v) polysorbate-20 and 10 mmol/L citric acid, pH 5.0.

The formulation can improve the solubility of F0002-ADC, and reduce the moisture of its freeze-drying sample. Long-term stability experiments confirm the formulation meet the clinical requirements of F0002-ADC.

Antibody-drug conjugate ; CD30; Formulation; Arg-HCl

SHEN Yi-jun, Email: yjshen@fd-zj.com

Author Affiliations: School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200000, China (ZHANG Heng-bin); Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201210, China (ZHANG Heng-bin, XU Jun, CAO Xue-mei, ZHANG Yi-fan, WU Jin-song, YANG Tong, SHEN Yi-jun)

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.004

200000 上海，復旦大學生命科學學院（張恒賓）；201210 上海復旦張江生物醫藥股份有限公司（張恒賓、徐珺、曹雪梅、張一帆、吳勁松、楊彤、沈毅珺）

沈毅珺，Email：yjshen@fd-zj.com

2019-08-12