噬菌體展示系統(tǒng)篩選糖尿病相關抗原蛋白及應用效果評價

劉堯，林駿，梁永羿，山云，王洪濤，徐良

論著

噬菌體展示系統(tǒng)篩選糖尿病相關抗原蛋白及應用效果評價

劉堯，林駿，梁永羿，山云，王洪濤，徐良

用噬菌體展示系統(tǒng)篩選與糖尿病相關的自身抗原新表位，表達新抗原肽段并評價其在糖尿病診斷中的應用效果。

以 I 型糖尿病血清作為靶分子，對 Ph.D.-12 噬菌體肽庫進行淘選，測序淘選的噬菌體并用 ELISA 檢測噬菌體與靶分子的結合效果，BLAST 分析特異性最好的表位與糖尿病的相關性，選擇合適的目的基因合成重組質粒，用 Expi 293 細胞表達新抗原肽段并檢測該抗原與臨床血清的特異結合效果。

共完成 2418 個噬菌體單克隆的測序，淘選出 93 種表位序列，11 種具有代表性的表位中測序超過 200 次的有 4 種，對特異性最強的表位序列“-GTFLFSLCAAVY”進行分析后選擇 mTOR 相關蛋白 mEAK-7 作為目的基因，抗原肽段與臨床血清的特異性結合效果為：I型糖尿病陽性率為 17%，II型糖尿病陽性率為 4%。

mEAK-7 蛋白對糖尿病血清具有一定的抗原特異性，該基因與糖尿病可能有相關性，具有很好的研究價值。

噬菌體展示系統(tǒng)； 糖尿病； 自身抗體； 抗原表位

I 型糖尿病是由于自身免疫系統(tǒng)錯誤攻擊和損傷胰島β 細胞，使胰島素合成和分泌減少或者完全缺失的自身免疫性疾病，臨床上大多數(shù) I 型糖尿病患者可被檢測到胰島自身抗體，目前來說，GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA2A 這 5 種胰島自身抗體是 I 型糖尿病檢測應用最廣泛、最受認可、相關性最強的自身免疫標志物[1-2]。本研究通過噬菌體展示系統(tǒng)獲得與糖尿病相關的自身抗原新表位的氨基酸序列進行自身抗原肽段的表達，評估包含抗原表位在內人工構建的蛋白多肽對于糖尿病診斷的臨床價值和意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑

噬菌體展示試劑盒和ER 2738 購自 Biolab 公司；培養(yǎng)基組分、Xgal、IPTG 購自美國 Sigma 公司；抗-M13 抗體（HRP）購自英國 Abcam 公司；限制性內切酶和Expi 293 真核表達系統(tǒng)購自美國 Thermo Fisher 公司；去內毒素質粒抽提試劑盒和蛋白電泳試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司；ELISA 板購自美國康寧公司；TMB 單組分顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；糖尿病抗體檢測試劑盒、全自動免疫印跡分析儀購自深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司；全波長酶標儀購自美國 Thermo Fisher 公司；菌株DH5α 由本實驗室保存；其他化學試劑為分析純以上等級。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體展示系統(tǒng)的淘選方法 分別收集來自健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者的血清，并將健康人，I 型糖尿病血清包被于 96 孔板中，150 μl/孔。TBST 溶液洗板 6 次，添加封阻液封阻，取 100 μl 原始噬菌體文庫（2 × 1011PFU）添加到包被有健康人血清的孔里，室溫作用 1 h，回收未結合的噬菌體液。將回收的噬菌體液添加到包被I型糖尿病血清的孔里，室溫作用 1 h，TBST 洗板 10 次，用洗脫液洗脫與I型糖尿病血清特異性結合的噬菌體。將特異性噬菌體感染至大腸桿菌 ER 2738 中擴增 4.5 h，離心，取上清，用 PEG/NaCl 4 ℃沉淀過夜。次日將沉淀物離心，棄上清，將沉淀物溶于 TBST 溶液中，此即擴增的噬菌體。將淘選后的噬菌體進行滴度測定、擴增，進入下一個循環(huán)淘選。每一輪進行 4 個循環(huán)淘選，一共進行4 輪淘選。

1.2.2 測序淘選的噬菌體 取每個循環(huán)淘選后未擴增的噬菌體液 5 μl 感染至大腸桿菌 ER 2738 并涂于含有四環(huán)素的 LB 培養(yǎng)皿上，37 ℃孵育過夜，隨機挑取 160 個單克隆噬菌斑，擴增后將單克隆噬菌體送至上海生工進行測序。剩余噬菌體液保存于 4 ℃用于后續(xù) ELISA 檢測實驗，或者用滅菌甘油 1:1 稀釋后，–20 ℃貯存。

1.2.3 ELISA 檢測噬菌體對靶分子的特異性 對所有序列的測序數(shù)據進行統(tǒng)計和分析，將測序頻次高于 200 的噬菌體進行擴增并滴定。準備兩個96 孔微孔板，每個待鑒定克隆分別在每個板上對應一列孔（12 個孔）。板 1 用于包被 I 型糖尿病血清后進行 ELISA 檢測所選序列與靶分子的結合力；板 2 僅用封阻液封阻后作為空白對照用于檢測所選序列對 BSA 包被塑料板的結合力。將 1 × 1012PFU 的噬菌體進行 5 倍系列梯度稀釋至第 12 孔，濃度分別為：1 × 1012、2 × 1011、4 × 1010、8 × 109、1.6 × 109、3.2 × 108、6.4×107、1.28 × 107、2.56 × 106、5 × 105、1 × 105和 2 × 104PFU，用多通道移液器將稀釋好的噬菌體吸取 100 μl 加入包被有靶分子的板 1 的對應孔中，再吸取 100 μl加入板 2 的對應孔中，每個濃度梯度做 3 個重復。室溫振蕩作用 1 h，洗板 6 次，添加稀釋后的抗-M13 抗體（HRP 標記），200 μl/孔，室溫作用1 h，洗板 6 次后每孔加入 200 μl 底物溶液，室溫作用 20 min，酶標儀檢測 405 nm 處的吸光度。

1.2.4 分析表位序列與糖尿病的相關性 將上述驗證特異性最好的表位序列導入 NCBI 數(shù)據庫中進行 BLAST 分析，查找與該表位序列具有同源關系的人源的氨基酸或蛋白片段，分析其與糖尿病、胰島 β 細胞或者相關疾病的關系，定位與糖尿病自身抗體相關的抗原表位。

1.2.5 重組蛋白表達 選擇與糖尿病相關性最大的基因，設計與之對應的核苷酸編碼序列，以定位的抗原表位為中心向該基因上下游分別延伸約200 個堿基作為目的基因，選取pcDNA 3.1 作為真核表達載體，合成重組質粒。將合成的重組質粒酶切并電泳鑒定后擴大培養(yǎng)，抽提無內毒素質粒并轉染進 Expi 293 細胞中進行重組蛋白的表達，收集表達的細胞培養(yǎng)液，電泳檢測表達效果。

1.2.6 ELISA 檢測重組蛋白的抗原特異性 將純化的重組蛋白稀釋至 1 μg/ml，添加到 96 孔板中，100 μl/孔，在 4 ℃包被過夜；PBST 溶液洗板 3 次，加入封阻液封阻，用樣品稀釋液分別將健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者的血清稀釋 100 倍，添加到 96 孔板中，每個樣本一個孔，室溫孵育 30 min，洗板 3 次，添加稀釋后的 HRP 標記的兔抗人 IgG，100 μl/孔，室溫作用 30 min，洗板 3 次后每孔加入 100 μl 的 TMB 顯色液，室溫孵育 15 min，每孔加入100 μl 終止液，酶標儀檢測各孔 450 nm 吸光度。

1.2.7 與其他糖尿病自身抗體對比 用糖尿病抗體檢測試劑盒和全自動免疫印跡分析儀分別對健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者的血清進行檢測，統(tǒng)計 GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA2A 的陽性率。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據采用 GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析及作圖，多組差異比較采用單因素方差分析，以< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 淘選的表位序列測序結果

本實驗每輪淘選出 640 個單克隆噬菌體（表 1），經過 4 輪淘選的送測序樣本共計 2560 個，最終獲得有效測序樣本共計 2418 個，占總樣本的 94.4%，共淘選出 128 種表位序列，其中 15 種表位序列出現(xiàn)的頻次較高，具有一定代表性。排除各輪之間 35 種重復序列后得到特異表位序列 93 種，排除各輪之間 4 種重復代表性表位序列后得到代表性特異表位序列 11 種，代表性特異表位序列樣本數(shù)為 1620 個（表 2），占有效測序樣本的 67%。

表 1 淘選的表位序列結果

表 2 具有代表性的特異表位序列統(tǒng)計結果

2.2 ELISA 檢測噬菌體對靶分子的特異性

ELISA 檢測結果顯示同一種噬菌體在濃度為 1 × 1012、2 × 1011和 4 × 1010PFU 時檢測值差異較小，但 P12-3 在各個濃度梯度的檢測值都與其他噬菌體差異較大（< 0.0001），比其他幾個噬菌體的檢測值高至少 3 倍。雖然 P12-1 和 P12-2 出現(xiàn)的頻次高于 P12-3，但是 P12-3 的特異性明顯強于其他幾種噬菌體，特異性由強到弱分別是：P12-3 > P12-2 > P12-1 > P12-4（圖 1A）。P12-1、P12-2 和 P12-4 只有在濃度大于 8 × 109PFU 時才有明顯的檢測效果，而 P12-3 在濃度介于 2.56 × 106~4 × 1010PFU 之間的檢測結果有良好的線性關系（y = 3E + 09x2– 4E + 09x + 6E + 08，2= 0.9984）（圖 1B）。

2.3 BLAST 分析多肽序列

將特異性最高 P12-3 的表位序列“-GTFLFSLCAAVY”導入 NCBI 數(shù)據庫進行 BLAST分析，與該序列具有同源性的人源基因共有 60 個序列，統(tǒng)計后獲得 5 個與該序列具有較高同源性的人源基因（表 3）。

2.4 重組質粒及真核表達的目的蛋白的鑒定

通過分析，選取與“-GTFLFSLCAAVY”同源性最高的 mTOR 相關蛋白 mEAK-7 作為目的基因并合成重組質粒，合成 DNA 分子量約為 480 bp（圖 2A），經過真核細胞 Expi293 表達，重組的 mEAK-7 分子量約為 18 kD，符合預期重組蛋白的分子量大小（圖 2B）。

2.5 ELISA 檢測表達的重組蛋白的抗原特異性

將純化后的重組蛋白作為抗原包被在 96 孔板上，用 ELISA 方法檢測健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病血清（各 200 例）與重組蛋白的特異性反應，結果顯示，健康人樣本均呈現(xiàn)陰性結果，I 型糖尿病樣本有 34 個呈現(xiàn)陽性結果，陽性率為 17%，II 型糖尿病樣本有 8 個出現(xiàn)陽性結果，陽性檢出率為 4%，說明 mEAK-7 蛋白對于糖尿病患者血清具有一定的特異性（圖3）。

圖 1 噬菌體與靶分子的特異性檢測（A：ELISA檢測不同表位的噬菌體在不同濃度條件下與靶分子的特異性識別；n = 3，*P < 0.0001；B：ELISA分析P12-3的檢測線性范圍）

Figure 1 Specific identification of phage and target molecules (A: Specific identification of target molecules and different epitopes at different concentrations by ELISA; n = 3,*< 0.0001; B: Linear range of ELISA analysis for P12-3)

表 3 表位序列同源性分析結果

1：單酶切；2：雙酶切；3：對照；4：mEAK-7；M：Marker

Figure 2 Identification of recombinant plasmids and recombinant proteins (A: Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant plasmids; B: SDS-PAGE analysis of recombinant protein)

圖 3 ELISA 檢測重組蛋白與臨床血清的結合效果

Figure 3 Identification of the binding effect of recombinant protein and clinical serum by ELISA

2.6 免疫印跡法檢測其他糖尿病自身抗體陽性率

用免疫印跡法對健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者血清（各 200 例）進行檢測，結果顯示I 型糖尿病患者血清中 GADA 和 ZnT-8A 陽性率較高（表 4），分別為 61.5% 和 52%，ICA、IAA、IA-2A 的陽性率介于 17% ~ 20%，與 mEAK-7 的陽性檢出結果近似；II 型糖尿病患者血清的 GADA陽性率也是最高的，達到 17.5%，ZnT-8A、ICA、IAA、IA-2A 的陽性率均小于 10%，而 ICA 和 IA-2A 的陽性率分別為 4.5% 和 4%，與 mEAK-7 的陽性檢出結果類似。

表 4 GADA、ICA、IAA、ZnT-8A、IA-2A 的陽性率檢測

3 討論

mTOR 信號通路在生物體內眾多細胞信號通路中占據相當重要的地位，參與調控如增殖、生長、分化、凋亡等多種生命現(xiàn)象，同時在炎癥、腫瘤、代謝和心血管疾病的發(fā)病機制中起重要作用。已有文獻報道 mTOR 信號通路與胰島素和糖代謝相關，在長期高濃度的葡萄糖刺激下，信號通路 Insulin/PI3K/PKB 下游的 mTOR/S6K1 處于激活狀態(tài)，過度表達而抑制胰島素的信號傳導，從而引起胰島素抵抗[3-4]。目前關于 mEAK-7 相關功能的研究報道很少，也沒有文獻提出其與糖尿病相關，但有報道提出 mEAK-7 能夠將 mTOR 招募到溶酶體中與其相互作用，通過 S6K2 和 4E-BP1 激活另一種 mTOR 信號通路，調控細胞增殖和遷移[5]。因此，mEAK-7 有可能通過調節(jié) mTOR 信號通路而調節(jié)胰島素分泌。

噬菌體展示技術成為探測蛋白空間結構、探索受體與配體之間相互作用結合位點、尋找高親和力和生物活性的配體分子的有利工具，噬菌體展示技術目前已廣泛應用于細胞生物學、食品、環(huán)境、農業(yè)、醫(yī)藥等領域[6-9]。本研究應用噬菌體展示技術最終篩選出的特異性最高的抗原表位“-GTFLFSLCAAVY”，且 ELISA 實驗證明真核表達的 mEAK-7 蛋白能夠與糖尿病血清中的靶分子有一定的特異結合效果。與目前廣泛認可的糖尿病自身抗體GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA-2A 陽性率對比，mEAK-7 在 I 型糖尿病中的陽性率接近于ICA、IAA、IA-2A 的陽性率，在 II 型糖尿病中的陽性率接近于 ICA、IA-2A 的陽性率，因此mEAK-7 對糖尿病自身抗體的檢測具有一定的輔助作用，為深入研究糖尿病自身抗原抗體提供一定的實驗依據。

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Screening of diabetes-associated antigen protein by phage display system and evaluation of its application effect

LIU Yao, LIN Jun, LIANG Yong-Yi, SHAN Yun, WANG Hong-tao, XU Liang

We aim to screen a novel epitope of antigen associated with diabetes by phage display system, andexpress new antigenic peptides and evaluate its potential application in the diagnosis of diabetes.

Type 1 diabetes patients serum were used for the panning of the Ph.D.-12 phage display library, and the selected phases were sequenced and the binding effect of the phage on the target molecule was detected by ELISA. The correlation between the best specific epitope and diabetes was analyzed by BLAST, and appropriate target gene was selected to construct recombinant plasmid. The new antigen peptide was expressed in Expi 293 cells and detected for specific binding effect on clinical serum.

A total of 2418 phage monoclonal sequences were sequenced, and 93 epitope sequences were selected, from which 4 of the 11 representative epitopes were sequenced more than 200 times. The best specific epitope sequence was identified as “-GTFLFSLCAAVY”. After analysis, mTOR-associated protein mEAK-7 was selected as a target gene, and the positive rate for the specific binding effect of the antigen peptide on clinical serum was 17% and 4% in type I and II diabetic serum, respectively.

mEAK-7 protein may have specific binding effect on diabetic serum. This gene may be related to diabetes and has good research value.

Phage display system; Diabetes; Autoantibody; Antigen epitope

XU Liang, Email: xuliang@szda.gov.cn

Author Affiliations:In-vitro Diagnostic Reagents Testing Department, Shenzhen Institute for Drug Control/Shenzhen Testing Center of Medical Devices, Gungdong 518057, China

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.007

廣東省食品藥品監(jiān)督管理局科技創(chuàng)新項目（2018ZDB14）；深圳市科技計劃項目（JCYJ20170307090049352）

518057 深圳市藥品檢驗研究院/深圳市醫(yī)療器械檢測中心體外診斷試劑部

徐良，Email：xuliang@szda.gov.cn

2019-09-09