Vasostatin-1對缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷的影響

高博，胡芳芳，高艷鳳

論著

Vasostatin-1對缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷的影響

高博，胡芳芳，高艷鳳

探討血管生成抑制因子vasostatin-1（VS-1）對缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞的炎性損傷作用及機制。

采用缺氧復(fù)氧方式制造腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷。構(gòu)建慢病毒載體并以脂質(zhì)體法將shVS-1 轉(zhuǎn)染 NRK-52E 細(xì)胞。ELISA 法檢測細(xì)胞中 LDH 和 IL-1β 含量；Western blot 檢測細(xì)胞中 VS-1、pro-caspase-1 和 caspase-1 蛋白表達。

與對照組相比，缺氧復(fù)氧組細(xì)胞 LDH 和 IL-1β 含量顯著升高，且 VS-1 蛋白表達顯著升高。成功構(gòu)建沉默 VS-1 的慢病毒載體，且轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧 NRK-52E 細(xì)胞，可降低細(xì)胞中 LDH 和 IL-1β 含量、降低 caspase-1 蛋白表達，過表達 VS-1 則具有相反的功能。

沉默 VS-1 可保護缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞的炎性損傷，可能與下調(diào) caspase-1 有關(guān)，可為急性腎損傷的臨床治療提供依據(jù)。

Vasostatin-1； 缺氧復(fù)氧； 腎小管上皮細(xì)胞； 炎性損傷； 炎性因子

急性腎損傷又稱急性腎衰竭，是一種涉及多種疾病的臨床常見危重病癥[1]。醫(yī)院患者急性腎損傷的發(fā)生率在 1.4% ~ 25.9%，死亡率為 60.3%[2]。炎癥反應(yīng)是引起缺血再灌注腎損傷的重要原因，腎小管上皮細(xì)胞為缺血再灌注腎損傷的重要效應(yīng)細(xì)胞，是腎臟炎癥介質(zhì)的關(guān)鍵[3]。血管生成抑制因子vasostatin-1（VS-1）是在應(yīng)激狀態(tài)下由脊椎和無脊椎動物神經(jīng)、內(nèi)分泌以及彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)釋放的嗜鉻粒蛋白 A 通過組織特異性加工程序產(chǎn)生的N 端 1 ~ 76 酶解多肽片段，具有舒張血管、促進機體固有免疫、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附等多種組織非特異性穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用[4-6]。各種炎癥因子，如腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長因子，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷、內(nèi)皮屏障功能紊亂和血管滲漏以吸引炎癥中單核巨噬細(xì)胞聚集、黏附內(nèi)皮、遷入內(nèi)皮下間隙形成泡沫細(xì)胞[7]。VS-1 具有促進血管舒張，減少內(nèi)皮細(xì)胞的趨化、增殖、血管滲漏及抑制炎癥細(xì)胞黏附的功能[8]。VS-1 在冠狀動脈病變組織中低表達，但在外傷或炎癥應(yīng)激狀態(tài)下表達明顯升高[9]。但 VS-1 在炎癥狀態(tài)下升高的機制尚未闡明。VS-1 在慢性結(jié)腸炎和腫瘤新生血管形成中均有報道[10-11]。大量研究報道 VS-1 在缺血性心臟疾病的防治中具有很大潛力。但 VS-1 在急性腎損傷中的作用機制尚未完全清楚。本研究將建立缺氧復(fù)氧（H/R）腎小管上皮細(xì)胞損傷，構(gòu)建沉默 VS-1 的慢病毒載體和沉默 VS-1 的缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞，觀察沉默 VS-1 對缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷和炎癥因子 caspase-1 的影響，揭示沉默 VS-1 可保護缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞的損傷，可能與下調(diào) caspase-1 有關(guān)，為急性腎損傷的臨床診斷治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠腎小管上皮細(xì)胞 NRK-52E 購自 ATCC 細(xì)胞庫；DMEM 培養(yǎng)基、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、HQ 高純度質(zhì)粒抽提試劑盒、LipofectamineTM2000、PUC-T 載體連接試劑盒、R I、I 內(nèi)切酶均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PVDF 膜購于德國羅氏診斷有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-1β 檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；凝膠成像分析儀購自日本柯達公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，置于 37 ℃、5% CO2和 95% 空氣的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞模型 當(dāng)細(xì)胞長到對數(shù)生長期時，用無血清的 DMEM 培養(yǎng)基處理細(xì)胞 24 h，培養(yǎng)液用不含血清和抗生素的磷酸鹽緩沖液、換用 1% O2+ 94% N2+ 5% CO2混合氣體的37 ℃缺氧箱中缺氧培養(yǎng) 4 h。然后復(fù)氧培養(yǎng)，如 1.2.1 培養(yǎng)方法培養(yǎng) 3、6、12 和 24 h，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液上清。

1.2.3 構(gòu)建沉默 VS-1 的慢病毒載體 shVS-1 核苷酸序列由美國 Invitrogen 公司合成，然后將 shVS-1 插入到表達載體 PUC-T，4 ℃連接過夜，瞬時轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，然后搖菌培養(yǎng)，涂板過夜培養(yǎng)。挑取單克隆株擴大培養(yǎng)，用 HQ 高純度質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。構(gòu)建質(zhì)粒 shVS-1，最后將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 DH5α 中。在轉(zhuǎn)化平板中挑取克隆株并驗證其是否與插入基因片段一致。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將構(gòu)建載體 shVS-1、Scrambled 和 pcDNA、pcDNA-VS-1 用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染到常規(guī)培養(yǎng)的 NRK-52E 細(xì)胞。然后進行缺氧復(fù)氧培養(yǎng) 12 h。轉(zhuǎn)染-制造細(xì)胞損傷成功后用于酶聯(lián)免疫吸附試驗、Western blot 實驗。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗 按照檢測試劑盒的技術(shù)手冊檢測細(xì)胞中 LDH 和 IL-1β 含量。

1.2.6 Western blot 實驗 取適量缺氧復(fù)氧處理 12 h 的 NRK-52E 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞，RIPA 裂解液裂解后，提取總蛋白，BCA 法蛋白定量后變性，按照 Western blot 實驗步驟進行操作。以目的條帶灰度值與內(nèi)參 GAPDH 灰度值的比值表示目的蛋白 VS-1、pro-caspase-1、caspase-1 的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞的炎性損傷

缺氧復(fù)氧處理大鼠腎小管上皮細(xì)胞 NRK-52E 3、6、12 和 24 h，和對照組相比，LDH 含量均顯著升高（圖 1A），IL-1β 含量均顯著升高（圖 1B），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）。最佳致 NRK-52E 細(xì)胞損傷時間為 12 h。

圖 1 缺氧復(fù)氧處理不同時間的腎小管上皮細(xì)胞 NRK-52E 的炎性損傷（A：LDH 的含量；B：IL-1β 的含量；*P < 0.05）

Figure 1 Inflammatory injury of renal tubular epithelial cells NRK-52E at different time after hypoxia reoxygenation (A: LDH content; B: IL-1β content;*< 0.05)

圖 2 缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞中 VS-1 蛋白表達升高（*P < 0.05）

Figure 2 Increased expression of VS-1 protein in hypoxic reoxygenated renal tubular epithelial cells (*< 0.05)

2.2 缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞中 VS-1 高表達

運用 Western blot 檢測缺氧復(fù)氧處理 12 h 的 NRK-52E 細(xì)胞中 VS-1 的蛋白表達，與對照組相比，VS-1 的蛋白表達量顯著升高（圖 2，< 0.05）。

2.3 構(gòu)建沉默 VS-1 的慢病毒載體

如圖 3 所示，與 Scrambled 慢病毒載體相比，shVS-1 慢病毒載體中 VS-1 的蛋白表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）。可見，成功構(gòu)建沉默 VS-1 的慢病毒載體。

2.4 沉默 VS-1 減輕缺氧復(fù)氧對腎小管上皮細(xì)胞的炎性損傷

shVS-1 組與 Scrambled 組相比，腎小管上皮細(xì)胞中 LDH 含量顯著降低（圖 4A），IL-1β 含量顯著降低（圖 4B），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）。可見，沉默 VS-1 可減輕缺氧復(fù)氧對腎小管上皮細(xì)胞的炎性損傷。

2.5 沉默 VS-1 抑制缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞 VS-1 蛋白表達

如圖 5 所示，轉(zhuǎn)染 shVS-1 組細(xì)胞與轉(zhuǎn)染 Scrambled 組相比，VS-1 蛋白表達顯著降低（< 0.05）。

2.6 沉默 VS-1 下調(diào)缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞 caspase-1

如圖 6 所示，shVS-1 組細(xì)胞與 Scrambled 組相比，caspase-1 蛋白表達顯著降低（< 0.05），pro-caspase-1 蛋白表達差異不顯著（> 0.05）。

圖 3 沉默 VS-1 對慢病毒載體中 VS-1 蛋白表達的影響（*P < 0.05）

Figure 3 Effect of silencing VS-1 on VS-1 protein expression in lentiviral vectors (*< 0.05)

圖 4 沉默 VS-1 減輕缺氧復(fù)氧對腎小管上皮細(xì)胞的炎性損傷（A：對 LDH含量的影響；B：對 IL-1β 含量的影響；*P < 0.05）

Figure 4 Silencing VS-1 attenuated inflammatory injury to renal tubular epithelial cells by hypoxia reoxygenation (A: Effect on LDH content; B: Effect on IL-1β content;*< 0.05)

圖 5 沉默 VS-1 抑制缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞 VS-1 蛋白表達（*P < 0.05）

Figure 5 Silencing VS-1 inhibited VS-1 protein expression in hypoxic reoxygenation renal tubular epithelial cells (*< 0.05)

圖 6 沉默 VS-1 下調(diào)缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞caspase-1（*P < 0.05）

Figure 6 Silencing VS-1 down-regulated caspase-1 in hypoxic reoxygenation renal tubular epithelial cells (*< 0.05)

圖 7 VS-1 過表達對缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響（A：免疫印跡圖；B：VS-1 蛋白相對表達量；C：對pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達的影響；D：對 LDH含量的影響；E：對 IL-1β含量的影響；*P < 0.05）

Figure 7 Effects of VS-1 overexpression on oxygenation of renal tubular epithelial cells (A: Immunoblot; B: Relative expression of VS-1 protein; C: Effect on pro-caspase-1, caspase-1 protein expression; D: Effect on LDH content; E: Effect on IL-1β content;*< 0.05)

2.7 VS-1 過表達對缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響

結(jié)果如圖 7 所示，與 pcDNA 組相比，pcDNA-VS-1 組細(xì)胞中 VS-1 的表達水平明顯升高，caspase-1 蛋白表達顯著升高，LDH、IL-1β 含量均顯著升高（< 0.05）。

3 討論

Vasostatin 類多肽在心血管循環(huán)系統(tǒng)中起到平衡調(diào)節(jié)作用，具有保護血管系統(tǒng)抵抗強烈興奮和應(yīng)激刺激的作用[12]。VS-1 在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中的研究非常普遍，VS-1 的復(fù)性肌力作用、抗心肌缺血再灌注損傷及抗心律失常作用已得到認(rèn)可[13-14]。目前關(guān)于 VS-1 與細(xì)胞炎癥因子的研究甚少。童玉娜[15]在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的研究中闡明，缺氧復(fù)氧可上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞中 IL-1β 和 caspase-1 表達，且成熟的 IL-1β 表達與 caspase-1 的表達相一致。本研究建立缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷，運用 Western blot 檢測 VS-1 蛋白表達發(fā)現(xiàn)，在缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞中 VS-1 高表達且可上調(diào) LDH 和 IL-1β。這些發(fā)現(xiàn)表明 VS-1 的表達與腎小管上皮細(xì)胞損傷分泌的炎性因子呈劑量依賴性。

VS-1 在不同生物中的作用機制是具有種屬特異性的，其對蛙和鰻魚心臟鈣/鈉通道的依賴性不同[16-18]。王錚[19]在心肌缺血再灌注損傷的研究中，通過構(gòu)建腺病毒重組的 VS-1 基因，并轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞和大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，運用 MTT 法檢測細(xì)胞活力，Annexin-V-FITC 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，揭示了 VS-1 在心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有顯著的抗缺氧復(fù)氧損傷作用。Liu 等[20]研究闡明，過表達 VS-1 可保護缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

本研究構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的沉默 VS-1 的缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷，運用 ELISA 法檢測 LDH 和 IL-1β 含量發(fā)現(xiàn)，沉默 VS-1 可下調(diào) LDH 和 IL-1β，可保護缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷，過表達 VS-1 則具有相反的作用，揭示了 VS-1 在急性腎損傷中的作用。VS-1 在缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用與心肌缺血再灌注損傷中的作用相反。

IL-1β 是炎癥反應(yīng)早期產(chǎn)生的多潛能細(xì)胞因子，可誘導(dǎo) TNFα、IL-6、IL-8 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，是引起腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷和凋亡的重要效應(yīng)分子[21]。Caspase-1 是 IL-1β 轉(zhuǎn)化酶，其為哺乳動物體內(nèi)剪切促炎因子 IL-1β 的特異蛋白酶，可將 pro-IL-1β 剪切為成熟的 IL-1β[22-23]。Gasman 等[24]研究運用 ELISA 法檢測腸源和胰源內(nèi)分泌腫瘤患者血清和正常人血清中 CgA 和 VS-1 的表達，揭示促生長抑制素治療可上調(diào)患者血清中的 CgA 但不影響 VS-1 的表達水平，提示 VS-1 可作為腸源和胰源內(nèi)分泌腫瘤的診斷標(biāo)記物。Rumio 等[10]在研究慢性結(jié)腸炎時，建立 DSS 誘導(dǎo)的鼠急性和慢性結(jié)腸炎模型，LPS 誘導(dǎo)的腸黏膜上皮細(xì)胞損傷，運用 ELISA 法檢測 VS-1、IL-8、CK 的含量，發(fā)現(xiàn) VS-1 抑制損傷細(xì)胞分泌TNFα、干擾素 c，且在動物模型中具有保護作用，揭示 VS-1 在動物體內(nèi)具有治療作用，該機制可能與抑制腸道的滲透力，對損傷腸黏膜的修復(fù)和抑制 IL-8/KC 及其他炎性因子的產(chǎn)生有關(guān)。本研究在前人的基礎(chǔ)上建立沉默 VS-1 的慢病毒介導(dǎo)的缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷模型，運用 Western blot 法檢測細(xì)胞中 caspase-1、pro-caspase-1 的蛋白表達，揭示沉默VS-1 可抑制缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞中 caspase-1的蛋白表達，提示沉默 VS-1 可抑制炎癥因子的分泌。這將為 VS-1 在不同種屬、不同組織中的特異性研究提供參考依據(jù)。

總之，沉默 VS-1 可保護缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞的炎性損傷，其可能與下調(diào) caspase-1 有關(guān)，可作為臨床治療急性腎損傷的理論依據(jù)。

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Effect of vasostatin-1 on inflammatory damage of hypoxic reoxygenation in renal tubular epithelial cells

GAO Bo, HU Fang-fang, GAO Yan-feng

To study the inflammatory injury mechanism of vasostatin-1 (VS-1) in renal tubular epithelial cells by hypoxic reoxygenation.

Inflammatory injury of kidney tubular epithelial cells was established by hypoxia reoxygenation. The lentiviral vector of shVS-1 was transfected into NRK-52E cells by liposome method. LDH and IL-1β levels in cells were detected by ELISA. The protein expression of VS-1, pro-caspase-1 and caspase-1 in cells were detected by Western blot.

Compared with the control group, the levels of LDH and IL-1β in the hypoxia reoxygenation group were significantly increased, and the protein expression of VS-1 was significantly increased. The lentiviral vector was successfully constructed. Transfection of silencing VS-1 lentiviral vector into NRK-52E cells with hypoxic reoxygenation could decrease LDH and IL-1β levels and downregulate caspase-1 expression, but overexpression of VS-1 possessed the opposite function.

Silencing VS-1 could protect the kidney tubular epithelial cells with hypoxic reoxygenation from inflammatory injury, which may be related to the down-regulation of caspase-1, which will provide a basis for clinical treatment of acute kidney injury.

Vasostatin-1; Hypoxia reoxygenation; Renal tubular epithelial cells; Inflammatory injury; Inflammatory factors

GAO Bo, Email: dongji991@163.com

Author Affiliation: Department of Nephrology, The People's Hospital of Anyang City, Henan 455000, China

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.010

455000 河南，安陽市人民醫(yī)院腎內(nèi)科

高博，Email：dongji991@163.com

2019-07-05