文昌雞白麻羽性狀與SLC45A2多態性關系

何藝平，陳 杰，高鑫鳳，許繼國

（1.廣州市畜牧科學研究所，廣東 廣州 510550；2.南昌師范學院生物技術研究所/江西省地方雞種遺傳改良重點實驗室/中國科學院家禽分子育種技術聯合實驗室，江西 南昌，330022；3.江豐實業股份有限公司，廣東 廣州 510450；4.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】通過有意識的育種，家養動物群體聚集了豐富的具有性狀效應（phenotypic effects）的變異[1]。作為全球生物多樣性重要組成部分的家養動物，不僅為人類提供了穩定的動物蛋白來源及許多有用的動物產品，其性狀多樣性還是研究基因型性狀之間關系的重要資源。實驗動物的變異常常具有病理性性狀，而家養動物中具有性狀效應的變異大部分不具有病理性性狀，是遺傳學研究的重要組成部分[2-3]。家雞的色素沉著性狀作為家養動物性狀多樣性的代表，備受生物學家和育種工作者關注。研究色素性狀的遺傳對于探討禽類起源、演化、生產以及開展實驗動物研究等方面都具有重要意義。

【前人研究進展】目前，在家雞中已經鑒定到了11個致因突變與羽色性狀相關，涉及10個基因[4-14]，其中2個為伴性遺傳（銀色羽和蘆花羽基因座位）[11,14]，10個為常染色體遺傳的基因座位。白麻羽性狀（亦稱為珍珠白）是文昌雞存在的一種較為典型的性狀，與黃麻羽性狀相比其主要特點是不能合成嗜黑素，并且不改變羽衣中真黑素和嗜黑素的相對分布（圖1）。關于文昌雞白麻羽的遺傳規律以及其形成的分子機制未見報道。根據白麻羽的性狀特征和遺傳方式以及Gunnarsson等[11]研究基礎，我們推測其是由銀色羽位點突變所致。

【本研究切入點】本研究首先檢測了已知的銀色羽突變位點與白麻羽性狀的關系，結果顯示其并非致因突變。之后通過正反交試驗探明了白麻羽性狀的伴性隱性遺傳規律。結合白麻羽性狀不能合成嗜黑素、不改變色素相對分布的特點以及其伴性遺傳的特征，我們首先猜測其很可能是位于銀色羽基因座位上一個新的等位基因，因此重新篩查了銀色羽對應的SLC45A2基因的多態性，并驗證了多態位點與白麻羽性狀之間的關系。從性狀來看，與野生型相比，白麻羽個體發生的是嗜黑素（黃色-紅色）合成障礙而并非嗜黑素和真黑素（褐色-黑色）的相對分布變化，因此我們猜測很可能是由于SLC45A2基因外顯子區域的錯義突變或者無義突變導致了嗜黑素合成障礙[11]。因此，本研究首先驗證了外顯子區域的錯義或者無義突變與白麻羽性狀的關系。【擬解決的關鍵問題】探索白麻羽性狀的遺傳規律，并找出對應的致因突變。研究結果可為白麻羽群體在育種中的利用以及相應性狀的分子標記輔助選擇提供依據。

圖1 白麻羽文昌雞（左）和黃麻羽文昌雞（右）Fig.1 Wenchang chicken with white-partridge feathers（Left）and Wenchang chicken with yellow-partridge feathers（Right）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試雞只來源于廣州市江豐實業股份有限公司育種場，其中白麻羽和黃麻羽公雞各1只，白麻羽和黃麻羽母雞各15只。禽血DNA抽提試劑盒購買自廣州飛揚生物科技有限公司。分子試驗部分所用離心機、PCR等儀器設備來源于廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 正反交試驗 分別用1只白麻羽公雞與15只黃麻羽母雞雜交，以及1只黃麻羽公雞與15只白麻羽母雞雜交。記錄每只種蛋后代對應的父母本，入孵出雛后佩戴翅號，并且記錄其父母本信息，6周齡時統計公母雞羽色分布。

1.2.2 DNA抽提 翅下靜脈采血，放于裝有抗凝劑的1.5 mL離心管中。根據OMEGA試劑盒說明書進行血樣DNA抽提。

1.2.3 多態位點篩選 根據候選基因SLC45A2序列設計特異性引物（表1），選用3個白麻羽純合子和6個黃麻羽純合子作為模板，對候選基因SLC45A2外顯子區域進行重測序，引物位置設計在外顯子兩側100 bp左右。利用DNAStar中的SepMan軟件讀取測序結果，并進行SNP篩選。

表1 供試引物信息Table 1 Information of the primers for trials

1.2.4 候選位點驗證 以白麻羽文昌雞、黃麻羽文昌雞、固始雞、霸王山雞、清遠麻雞、杏花雞和紅色原雞DNA為模板，設計特異性引物（表1），利用測序的方法對候選變異位點進行分型。

2 結果與分析

2.1 正反交試驗結果

白麻羽公雞與黃麻羽母雞雜交，后代公雞全部能合成嗜黑素，表現為黃蘆花性狀（黃白相間）；母雞不能合成嗜黑素，全部為白麻羽性狀。黃麻羽公雞與白麻羽母雞雜交，后代公雞和母雞均能夠合成嗜黑素，公雞表現為黃蘆花性狀，母雞表現為黃麻羽性狀（表2）。正反交試驗結果表明，白麻羽性狀呈現伴性隱性遺傳。

表2 正反交試驗結果統計Table 2 Result of the reciprocal cross experiment

2.2 SLC45A2多態性與白麻羽關系研究

2.2.1SLC45A2多態位點篩選 根據白麻羽性狀不能合成嗜黑素且不改變色素相對分布的特征、伴性遺傳的規律以及前人關于雞銀色羽性狀和白虎毛色形成分子機制的研究結果[11,15-16]，選取SLC45A2作為候選基因，篩選多態位點。以白麻羽和黃麻羽性狀個體的DNA為模板，對SLC45A2外顯子區域進行重測序，結果共篩選到5個SNP（表3），其中3個位于外顯子上，2個為錯義突變（SNP1、SNP4），1個為同義突變（SNP2）。

表3 SLC45A2基因SNPs位點信息Table 3 SNPs location information of SLC45A2 gene

2.2.2 候選位點驗證 根據白麻羽性狀不能合成嗜黑素以及不改變嗜黑素和真黑素相對分布的特點，推測與該性狀相關的突變是錯義突變，因此首先排除SNP2、SNP3和SNP5位點；又由于該性狀為隱性性狀，因此與該性狀相關的SNP位點在白麻羽群體中應該呈現純合子，因此排除SNP1位點（利用白麻羽性狀和黃麻羽性狀進行SNP篩選時，SNP1在白麻羽群體中出現了雜合子，數據未顯示）。根據上述分析，我們選取SNP4作為候選位點，以不能合成嗜黑素的白麻羽文昌雞與能合成嗜黑素的黃麻羽文昌雞、固始雞、霸王山雞、清遠麻雞、杏花雞和紅色原雞為材料，驗證SNP4位點與白麻羽性狀的關系。

采用Sanger測序的方法對被檢測個體的SNP4位點進行分型，結果顯示，所有能合成嗜黑素的品種均為GG基因型，而不能合成嗜黑素的白麻羽文昌雞均為CC基因型（表4）。上述結果顯示，SNP4位點（SLC45A2基因編碼區1154位點）的C等位基因與白麻羽性狀完全連鎖，很可能是白麻羽性狀的致因突變。

表4 SNP4位點在不同性狀群體中的分布情況Table 4 Distribution of SNP4 in different populations

3 討論

SLC45A2基因編碼區1154位點與文昌雞白麻羽性狀完全連鎖，可能是銀色羽基因座上的一個新的等位基因。Gunnarsson等研究發現，具有相似性狀的國外品種是由于SLC45A2基因上的突變位點〔C.C1039A（L347M）〕導致的[11]。在白麻羽文昌雞中雖然不存在該突變，但SLC45A2基因編碼區1154位點突變卻與白麻羽性狀呈完全連鎖的關系，可能該突變是一個新的銀色羽等位基因，而且這一突變很可能是致因突變，其原因有3個方面：（1）試驗結果顯示，該突變與文昌雞白麻羽性狀完全連鎖，并未在能夠合成嗜黑素的品種中發現該突變；（2）白麻羽性狀的特點是不能夠合成嗜黑素，可能是由于基因編碼區內發生錯義突變導致的，本研究中鑒定到的突變符合上述條件；（3）本試驗結果與白虎（不能合成嗜黑素但是可以合成真黑素）中的研究相似，白虎的形成也是由于SLC45A2基因上的一個錯義突變（A477V）導致的[15]。

由于動物的毛色是由真黑素和嗜黑素兩種色素在毛發中的相對分布導致的[16-18]，因此我們有理由相信大部分羽毛性狀是由于調控區的調節突變影響了參與色素合成的基因表達而導致的。大部分羽色多樣性都是由嗜黑素和真黑素組成，其不同只是表現為嗜黑素和真黑素的相對分布，嗜黑素和真黑素合成能力并沒有差別[19]。本研究中白麻羽性狀相對于黃麻羽性狀，其典型特征是不能合成嗜黑素，并且不改變色素的相對分布。因此，我們首先推測其很可能是編碼區的錯義或者無義突變導致基因無法行使正常的功能而導致的。本試驗結果較好地支持了這一猜測。

本研究在候選位點驗證時，選取了能合成嗜黑素的品種為相對性狀，在被測的群體中顯示SLC45A2基因編碼區1154位點在能合成嗜黑素的群體中不攜帶C等位基因。囿于條件限制，被用于驗證的6個群體5個在我國的廣東省和海南省，這降低了驗證的效力。未來可擴大驗證樣本的取樣范圍，進一步驗證SLC45A2基因編碼區1154位點與白麻羽性狀的關系。另外，還需要在細胞層面以及通過基因編輯的方式對SLC45A2基因編碼區1154位點進行功能驗證以及分析其對于白麻羽性狀形成的機制。SLC45A2基因突變導致白麻羽性狀的分子機理尚不清楚，因此還需要進一步研究。目前有關SLC45A2只影響嗜黑素的合成而不影響真黑素的合成的原因并沒有十分系統的試驗數據，但眾多研究結果提供了一些啟示，很可能是SLC45A2基因的錯義突變減少了機體全身黑色素的生物合成，但是高表達的EDN3維持了某些區域真黑素的合成[15]。

4 結論

本研究以分離出的白麻羽個體與黃麻羽個體進行正反交試驗，結果顯示白麻羽突變表型相對于野生型的黃麻羽為伴性隱性遺傳。根據白麻羽表型伴性隱性遺傳方式、白麻羽表型不能合成嗜黑素的表型特征（一般為基因功能缺失造成）和前人研究結果，我們選取SLC45A2基因外顯子區域的錯義突變作為候選致因突變進行了驗證。結果顯示，SLC45A2基因編碼區1154多態位點能將白麻羽群體與非白麻羽群體分開。綜合上述結果，得出初步結論，SLC45A2基因編碼區1154多態位點很可能是導致白麻表型的致因突變。該突變與白麻表型形成之間的分子機制有待進一步研究。