區域微型生物養護劑對池塘環境改善作用研究

劉春花，梁慧麗，孫承文，陶家發，鞏 華，石存斌，吳淑勤

（1.中國水產科學研究院珠江水產研究所，廣東 廣州 510380；2.廣州普麟生物制品有限公司，廣東 廣州 510380）

【研究意義】水產養殖業常出現區域特征的大規模發病流行，與病害發生最密切相關的共性問題是養殖水體環境惡化。水質惡化時，正常的微生態平衡遭到破壞，致病菌被激活、快速繁殖，并分泌毒素侵襲魚體，同時由于對環境變化的應激反應，魚體抵抗力下降，導致疾病暴發或流行[1]。改善養殖水環境的傳統技術手段主要是加大換水量，但這不僅浪費水資源，而且外排的養殖污水也會影響養殖區周圍的生態環境。常規的藥物調控方法將水體微生物、原生動物、藻類等微型生物作為藥物干預的主體對象，雖然對病害防控有一定效果，但藥物的過量使用常引起嚴重的惡性循環，水生態系統失衡，疾病也因此不斷發生[2]。而通過微生物制劑優化養殖水體微生物、原生動物、藻類等微型生物多樣性，則可以維護養殖環境動態相對穩定，促進養殖系統各層次關系的持續平衡，減少病害發生。

【前人研究進展】研究表明，水產養殖中應用微生物制劑不僅能分解和轉化水體中的有機物和無機氮等過剩物質，提高養殖系統對營養物質的轉化效率，減少水體污染，改善水質[3]，還可以通過與有害微生物競爭營養物質及生存繁殖空間等機制，抑制有害微生物的生長繁殖，降低水產動物的發病率[4]。但目前應用在水產養殖業中的微生物菌株大多是將農業部允許在畜禽飼料中添加的部分微生物、或從異地養殖區采集的微生物作為其出發菌株，將這些原來在陸地上、畜禽消化道或不同水體環境中生存的微生物直接用于水產動物，或者直接潑灑到養殖水體中，由于動物生活環境與生理狀態的差異，一方面可能微生態制劑可發揮的功效有限，另一方面則有可能引起一些難以預料的生態學問題[5]。

【本研究切入點】區域池塘水體微型生物養護劑（簡稱護料）[2]是中國水產科學研究院珠江水產研究所研發的新型微生物制劑，具有區域屬性，由養殖當地豐產池塘分離的土著微生物發酵當地農業生產次產品如麩皮、米糠、豆粕等制成，包含養殖池塘泥水、微生物菌群富集培養物和微生物培養料等組分，可根據不同養殖時期的需要，調整培養物料配比制成不同C/N比值的護料，與飼料關聯使用，并適時調節水體總堿度和總硬度，以維持養殖水體生態環境動態穩定，促進健康養殖。【擬解決的關鍵問題】本研究通過在實驗室內水族缸模擬的池塘生態環境使用護料，評價護料對水質因子、浮游藻類、原生動物及魚體的養護作用，以探討微型生物在水產養殖中維持水體生態環境動態穩定的作用機理與調節機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

2015年分別從南沙、清遠草魚養殖池塘采集塘泥及塘水，分裝在實驗室內設置于南向窗臺的4個透光玻璃水族缸（長49 cm×寬24 cm×高34 cm）中，使缸底鋪滿3～4 cm塘泥，對各水族缸分別編號，各試驗組的采樣背景及建模時情況見表1，每個試驗組設置2個重復。塘A、塘B位于廣州市南沙，塘A養殖魚體健康，生態條件良好；塘B養殖魚體發病，采樣時已使用抗生素類魚藥；塘C是清遠的一口荒廢老塘，水體有異味。處理1、處理3均采樣自塘A，但處理1從采樣過程引入水族缸的時間較處理3晚，藻體在不利環境中死亡過多，建模時藻類數量較少。試驗期間對水族缸充氣，以底泥不被吹起為宜。以窗臺的日照為光源，且每天于8: 30—18: 00開燈補充光照，當水溫降至18℃以下時，用電暖器室內加溫。

表1 建模時各試驗組情況Table 1 Situation of each experimental group at modeling time

1.2 實驗魚放養與存活監測

從廣東肇慶某苗場購進鳙魚（Aristichthys nobilis）（體長12±1 cm）、羅非魚（Oreochromis mossambicus）（體長 10±1 cm）、清道夫魚（Pterygoplichthys multiradiatus）（ 體 長 10±1 cm）等，暫養1周以上，分別向各處理引入健康的鳙魚3尾、羅非魚2尾、清道夫魚2尾，用粗蛋白含量為40%的浮性飼料投喂各處理試驗魚，撈出浮于水面未攝食完畢的全部剩料，陰、雨天氣時少投或停料，魚體死亡后立即撈出，計數。

1.3 微型生物養護劑的應用

從南沙、清遠草魚養殖區的代表性高產魚塘獲得護料的制備材料，按照專利“一種區域養殖水體微型生物養護劑及其制備方法”的方法制成護料[2]。處理1、2、4使用護料制成的料水，作為試驗組；處理3不使用護料，作為對照組。根據不同養殖時期的水質情況，護料在不同試驗階段的物料成分及C/N比值不同，開始模擬護料養護試驗當天記作D1，D1—D24時護料的C/N比值平均為18.18，D25—D60時C/N比值平均為21.75，D60—D90時C/N比值平均為24.12。

1.4 指標監測

1.4.1 水質指標監測 將采樣的泥水裝入水族缸，當缸內水體澄清開始模擬護料養護試驗，分別于 D1、5、10、20、30、40、50、60、90 用美國維賽儀器YIS ProPlu水質分析儀測量缸內pH值、氨氮、溶氧、水溫、亞硝酸鹽等各項水質指標，于D1、D90用廣州普麟生物制品有限公司的總堿度、總硬度檢測試劑盒分別測量缸內水體的總堿度和總硬度。

1.4.2 浮游藻類監測 于D1、5、10、20、30、40、50、60、90早上9:30采集水樣，用魯哥氏液固定、保存。計數浮游藻類的細胞數，以公式（1）計算藻類密度；計數密度較大藻類的數量，計算優勢種及主要種類的百分比；參考《中國淡水藻類志》等資料鑒定藻類種類，無法定種時鑒定到屬；以公式（2）計算浮游藻類的Margalef多樣性指數。

式中，N為每升水中浮游藻類細胞數，A為計數結果的平均值，B為計數的血球計數板中方格數，C為濃縮的倍數。

式中，d為多樣性指數，S為種類數，N為個體數。

1.4.3 底棲原生動物監測 于D10、20、30、40、50、60采集PFU泡沫（大小：50 mm×75 mm×65 mm，孔徑：100～150 μm）中的水樣，計數原生動物數量，以公式（3）計算原生動物密度；根據原生動物的形態，參考《水生生物學》等資料記錄底棲原生動物的種類；以公式（2）計算原生動物的Margalef多樣性指數。

式中，N為每升水中原生動物的數量，VD為沉淀體積，VS為采樣體積，n為計算個數，C為計算體積。

2 結果與分析

2.1 水體水質理化因子

水體總堿度、總硬度有地域差異（表2），處理1、2、3（南沙）的總堿度、總硬度水平均高于處理4（清遠）。試驗期間，各處理pH值、溶氧、氨氮等水質理化因子如表3所示，pH值7.1～8.6，溶氧4.03～8.01 mg/L，D1—D10水溫偏高、為 27～28℃，D20—D40 水溫為 23～24℃，D50—D90時氣溫偏低，通過在室內用電暖器加熱，使水溫保持18～19℃；D1—D10各組的水體氨氮及亞硝酸鹽濃度差異極大，處理2及處理4的氨氮與亞硝酸鹽濃度極高；隨后水體氨氮水平降低明顯，從D20起各處理間無明顯差異，維持較低水平；亞硝酸鹽水平在處理1、2、3中逐步降低，但處理4在D60前無明顯變化，D60后降至其他試驗處理的水平。

表2 水體總堿度、總硬度檢測結果Table 2 Testing result of total alkalinity and total hardness in water

表3 微型生物養護劑對水質因子、浮游藻類及原生動物的養護作用Table 3 Curing effect of micro biological conserving stuff on water quality factors, phytoplanktonand protozoa

2.2 浮游藻類的平均密度、種類與多樣性

整個采樣期間共有141種浮游藻類（圖1），隸屬6門70屬，綠藻門和藍藻門的種類數較多，分別有45屬100種、11屬18種，各占總種數的70.9%、12.8%。藻類的起始平均密度、種類數、多樣性指數（表3、圖2）均是處理4＞處理3＞處理2＞處理1，試驗過程中，浮游藻類震蕩增加，在護料的作用下，試驗組比對照組增速快、變動幅度窄，總體增長更平穩，尤以來源于健康養殖塘的處理1特征明顯；D90時平均密度、種類數及多樣性指數分別依次處理4＞處理1＞處理3＞處理2、處理2＞處理4＞處理1＞處理3、處理4＞處理2＞處理1＞處理3；處理1的平均密度及種類數明顯超出對照處理3，來源于不健康水體的處理2、處理4，其種類數與多樣性指數明顯增加，處理2的增長趨勢比處理4更明顯，但處理2的平均密度仍均低于對照處理3。藻類優勢種及主要種類的變動情況（表4）顯示，使用護料可將主要浮游藻類種類養護為綠藻門、硅藻門種類，并降低單一優勢種類的比例。

圖1 浮游藻類的種類組成Fig.1 Species composition of phytoplankton

表4 藻類主要種類的變動情況Table 4 Changes in major species of phytoplankton

圖2 不同處理的浮游藻類平均密度（A）、種類數（B）與多樣性指數（C）Fig.2 The mean density（A）, species number（B）and diversity index（C） of phytoplankton under different treatments

2.3 底棲原生動物的平均密度、種類與多樣性

試驗中，各處理以輪蟲、纖毛蟲為主，使用護料后水質得到改善，輪蟲、纖毛蟲數量增加。原生動物平均密度、種類數量及多樣性的變動情況如表3、圖3所示。試驗開始時，各處理原生動物的平均密度依次為處理3＞處理1＞處理2＞處理4，種類數及多樣性指數均依次為處理3＞處理1＞處理4＞處理2，試驗期間呈增長趨勢，D60時各處理的平均密度、種類數量及多樣性指數均是處理1＞處理3＞處理2＞處理4。在護料的作用下，處理1的平均密度及多樣性指數明顯超出對照處理3；來源于不健康水體的處理2、處理4，其物種豐富度明顯增加，處理2的增長趨勢比處理4更明顯，但平均密度與多樣性指數仍低于對照處理3；至D60，處理1、處理2的種類數各增加3種，處理3、處理4均增加1種。

2.4 放養魚類的存活情況

圖3 不同處理的原生動物平均密度（A）、種類數（B）與多樣性指數（C）Fig.3 The mean density（A）, species number（B） and diversity index（C） of protozoa under different treaments

放養魚類的存活情況如表5所示，使用護料后，各處理存活率依次為處理1（85.7%）＞處理2（57.1%）＞平均數（50.0%）＞處理4=處理3（28.6%）。4個處理中，鳙魚在處理1、處理2中均有1尾存活，在處理3、處理4組中全部死亡；羅非魚在處理1中全部存活，處理2中死亡1尾，處理3、處理4中死亡2尾；清道夫魚在處理1、處理2中全部存活，處理3、處理4中均死亡1尾。

表5 放養魚類存活情況Table 5 The survival statistics of fish

2.5 護料對健康池塘水體的模擬養護效果

處理1、處理3均取樣于南沙一口健康池塘，水質良好，水體微生物物種豐富，生態穩定。處理1在采樣后處理過遲，使得試驗開始時浮游藻類、原生動物損失較多，其平均密度、種類數及多樣性指數均低于對照處理3。使用護料的處理1，浮游藻類D20時平均密度達到峰值，在D20—D30期間短暫降低后，藻類數量持續快速增長，整個試驗期間小球藻（Chlorella vulgaris）始終維持較高比例。原生動物增長迅速，D20時即在數量上超過對照處理3；D30時種類數達到最多種，并保持不變，多樣性指數達峰值，隨后稍微降低。魚體存活率高達85.7%，對水質要求較高的鳙魚也存活良好。相比于此，不使用護料的對照處理3，采樣后處理及時，浮游藻類及原生動物的起始平均密度、種類數和多樣性指數均高于處理1，但試驗期間浮游藻類平均密度的震蕩幅度大于處理1，D30—D40期間單一種類小球藻占比極高、達70%，而D50時又驟降至20%，同時出現25%藍藻門藻類銀灰平裂藻（Merismopedia glauca）；隨著氣溫降低、陰雨天時間延長，D60后銀灰平裂藻激增、占比高達70%。原生動物增加強度不如處理1，增速慢，數量少，穩定性低，甚至在D30前的多樣性指數呈下降趨勢。魚類存活率低、僅28.6%，遠低于處理1，且僅剩對水質要求不高的羅非魚及清道夫。試驗結果表明，在健康塘使用護料后，浮游藻類與原生動物得到養護，放養魚類的存活率提高。

2.6 護料對非健康池塘水體的模擬養護效果

處理2的泥、水來自南沙一口發病池塘，試驗起始時構建的模擬生態條件差，氨氮水平較高，浮游藻類與原生動物的平均密度、種類數、生物多樣性指數均較低；處理4采樣于清遠一口荒廢老塘，該塘底為黏土底質，水體總堿度、總硬度水平偏低，氨氮水平極高，水體有異味，采樣時藍藻暴發。在護料的作用下，兩個試驗組的整體情況均得到改善，處理4在試驗開始1周后水體異味消失，處理2、處理4的氨氮水平均在D20時降低，與來源于健康塘的處理1、處理3水平相當，浮游藻類與原生動物的種群平均密度提高，種類數與多樣性指數明顯增長，處理2的魚類存活率為57.1%，明顯高于未用護料的對照處理3。但另一方面，因處理2的來源背景較差，D60后受氣溫降低的影響，藻類密度緩慢降低，嚙蝕隱藻（Cryptomonas erosa）與赤眼裸藻（Euglena sanguinea）增殖較快，提示水質有潛在變差的風險。而處理4起始條件差，且對水質起緩沖調節作用的堿度與硬度偏低，魚群結構不合理，隨著后期氣溫降低等多因素的影響下，D50時開始出現較高比例的銀灰平裂藻，在D90時大量暴發，種群數量高達70%，原生動物的生物多樣性水平偏低，魚體存活率也很低、僅28.7%。由處理2及處理4的試驗結果可知，只有在使用護料的同時結合調整魚群結構、適當提高堿度、硬度等綜合調控方式，才能養護池塘的生態環境穩定，促進健康養殖。

3 討論

3.1 護料對水質理化因子的影響

養殖水體的自身污染以及對養殖地區水域生態系統的危害已經成為當前嚴重的環境問題，利用微生物自身生理特性進行水質凈化的生物法，可以改善溶解氧，減少pH值波動，降低氨氮、硫化氫等有害物質，使水環境保持相對穩定，有效改善水質狀況，使水體中有益菌種成為優勢種群，從而減少病菌的滋生[6-7]。劉春花等[8]在草魚（Ctenopharyngodon idellus）養殖過程中潑灑一種商業有益微生物制劑，有利于優化養殖水體環境，與空白對照組相比，有益微生物組水體中的氨氮、亞硝酸氮鹽含量顯著降低。李曉英等[9]在中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）養殖池塘中施放了一種復合微生態制劑，可以使水體中的氨氮含量維持在一個相對穩定的狀態，亞硝酸鹽和硫化氫的含量也顯著低于對照池。本研究使用的護料是一種復合微生物制劑，其功能比單一微生物制劑廣泛、作用穩定、效果更佳，作用于非健康池塘水體處理2及處理4時，降氨氮的效果顯著，并在模擬試驗期間維持各處理的水質因子相對穩定。

3.2 護料對浮游藻類的影響

研究發現，不同的浮游藻類對氨氮和硝酸鹽的利用情況有差別，Glibert等[10]報道，硅藻對硝酸氮的利用超過氨氮，在硝酸鹽豐富的水體中硅藻往往是優勢種，而在氨氮豐富的水體中，藍藻和綠藻對氮的利用效率要高于其他藻類，此時藍藻和綠藻將占據優勢。而微生物則可以分解蝦池中對藍藻類等生長有積極影響的豐富有機質，并且微生物的自身分泌物對不同的藻類有不同影響[11]。莊惠如等[12]發現光合細菌（Photosynthetic Bacteria）對水中藻類有明顯影響，使得有益的硅藻、綠藻數量增加，藍藻數量降低。對南美白對蝦（Penaeus vannamei）養殖池塘使用不同微生物制劑，De等[13]發現，浮游植物結構會受影響，甲藻的生物量降低；Lukwambe等[14]則發現，浮游植物的生物量減少，其中增加了硅藻門的比例，降低了藍藻門的比例。本研究中，護料對模擬池塘水體的浮游藻類有良好的養護作用，使用護料后，藻類密度及多樣性指數增速快、變動幅度窄，可將主要浮游藻類種類養護為綠藻門、硅藻門種類，可能是由于護料微生物菌株為經過持續馴化的土著微生物，可有效對模擬試驗組水體中含氮營養物進行選擇性利用，持續分解的代謝產物更適合當地水體綠藻門、硅藻門藻類的繁殖，促使藻類穩定增長，同時某些微生物菌株對特定藻類有抑制或溶解作用，使藍藻不能暴發性增長，維持藻相結構的相對穩定。

3.3 護料對原生動物的影響

在池塘生態系統中，原生動物密切地與其生存的環境直接接觸，能直接、迅速地反應環境變化，發生規律性變化[15-16]。池塘投入微生態制劑后，形成新的微生物群落，從而影響水生態系統中的營養鹽及能量在微生物群落中的流動途徑及其各種微生物之間的代謝偶聯關系，接種有益微生物的水體中浮游動物數量最多，生物量最大[17]。Zink等[18]將微生物制劑應用到褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）培養中，可以增加輪蟲種群的數量和種群穩定性。這些結論與本研究相同，原生動物的增長與水體餌料生物（如藻類、細菌）和營養物質（如氮）數量密切相關，使用護料的試驗組，微生物菌株有效地降解水中有機物，為浮游藻類的繁殖提供營養物質，促進藻類繁殖，這些藻類的光合作用，又為好氧菌、原生動物提供氧氣，從而形成一個良性的生態循環，促使原生動物的平均密度顯著增加，種類數變化趨勢相對穩定，多樣性指數得以豐富。

3.4 護料對魚體的影響

微生物制劑一方面通過在空間、時間、定居部位和營養等展開競爭，抑制致病菌的生存和繁殖[19]，另一方面通過刺激機體產生干擾素，有效提高免疫球蛋白濃度和巨噬細胞活性，激發機體的免疫機能，增強機體免疫力[20]，對水生動物的生存起促進作用。如芽孢桿菌（Bacillus）成為優勢菌種后能產生枯草素等物質，可抑制其它細菌的生長，減少甚至消滅病原體，減少疾病發生[21]。也有研究報道，微生物制劑的有益菌可在動物腸道內繁殖，產生多種營養物質，促進機體的消化吸收功能，促進水生動物的生長[22]。本研究也進一步驗證了微生物制劑對魚體的促進作用，使用護料可顯著提高放養魚類的存活率。

3.5 護料的優勢特征分析

雖然微生物制劑在動物的整個養殖過程都可以使用，但不同養殖時期的劑量及作用效果卻不盡相同，在不同的水質條件下發揮出的作用與功效也不一樣，有可能在使用后不適應當地氣候、生態環境，導致效應期延長或使用效果不明顯。在改良水質環境時，微生物制劑的菌株不可避免會與土著菌株發生競爭[23]。而當前作為水產用微生態制劑的出發菌株大多是來自畜禽消化道內的原籍菌株，這些微生物對于水產動物生理狀況和生存環境究竟有何種程度的影響，尚缺乏系統研究，也沒有明確結論[5]。此外，有研究證明碳氮比能改變養殖水環境中細菌群落和功能[24-25]，通過補充碳水化合物以提高水體碳氮比，可促進異養微生物利用水體中氮合成自身蛋白，從而降低水體氮化合物、提高飼料利用率[26]，一些能抑制有害病菌的益生菌比例則會隨著碳氮比升高而升高[25，27]，而添加不同碳源對水體水質、藻類和微生物群落的調控存在差異[28]。本研究護料使用的菌株是經持續馴化的養殖當地豐產池塘的土著菌族，菌株培養基組方C/N動態調整，以匹配不同養殖時期的投喂飼料粗蛋白水平與池塘N積累程度。基于水產養殖發病與區域水土、氣候、養殖習慣等關系密切，往往形成區域特征的發病規律，及養殖結構不盡合理，池塘C/N比值普遍較低（一般低于10）等現象，池塘微生物養護劑的應用關聯了“護料-飼料-濾食性魚類搭配”三元素，在不同養殖時期，使用承載相應期土著微生物族群和相匹配C/N的護料，優化區域養殖水體微生物、原生動物、藻類等微型生物多樣性，以維護養殖環境動態穩定，進而促進養殖系統各層次關系的動態平衡，使得養殖過程不易發生疾病。

4 結論

本研究以養護養殖水體微型生物多樣性為導向，以護料為載體，將土著良好菌族在同區域內共享，關鍵銜接養殖對象、飼料、水體總堿度與總硬度等系統元素，目標是促進“微生物-原生動物-藻類”“養殖對象-飼料-環境” “病原-宿主-環境”等多層次關系的平衡，使得病原在養殖系統多樣性機制中共存而不致病。水族缸中模擬的池塘養殖環境在護料的作用下，水質因子維持在一個相對穩定的狀態，藻類密度及多樣性指數增速更快、變動幅度更窄，更易將主要浮游藻類種類養護為不產生藻毒素的綠藻門、硅藻門種類，原生動物種類和數量均增加明顯，顯著提高魚體存活率。微生物養護技術適合于養殖區域規模化、高效、精準應用，操作簡單、成本低，有利于水產養殖生態系統持續改善，可降低區域養殖病害發生率、改善養殖產品品質、提高養殖效益。