血液來源表皮葡萄球菌生物被膜形成能力及agr 基因多態(tài)性調(diào)查

胡洪華 喻 華 黃文芳 楊永長

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610072

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，SE）是一種常定居于人體皮膚表面和黏膜表面的共生菌，通常被認(rèn)為是非致病菌[1]。近年來，各種植入性醫(yī)用材料等在臨床應(yīng)用日益增多，SE 已成為院內(nèi)感染的重要致病菌。有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，美國每年用于治療SE 引起的血流感染的費(fèi)用約20 億美元[2]。SE 的最主要致病因素是形成生物被膜，生物被膜的形成受多基因的調(diào)節(jié)，附屬基因調(diào)節(jié)因子（accessory gene regulator，agr）是SE 生物被膜形成過程中重要的調(diào)控因子[3]。SE 形成生物被膜，導(dǎo)致持續(xù)性和反復(fù)性感染，已引起臨床高度重視。本研究以臨床分離血液來源SE 為研究對象，分析其agr 基因多態(tài)性和生物被膜的形成能力。

1 材料與方法

1.1 菌株收集

SE 來自于2012 年3 月～2015 年2 月四川省人民醫(yī)院住院患者分離的血液來源菌株，無重復(fù)菌株，所有菌株采用全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)VITEK 2.0 鑒定。

1.2 儀器和試劑

PCR 反應(yīng)試劑盒（北京康為世紀(jì)公司，批號：40111）；DNA 提取液（達(dá)安基因公司，批號：20190226）；結(jié)晶紫（Baso 公司，批號：419012）；PTC-200 型PCR 擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 DNA 的提取

常規(guī)復(fù)蘇菌株，接種于血平板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)20 h，挑起單克隆于1 mL 的生理鹽水中，10 000 r/min離心5 min，離心機(jī)半徑9.5 cm，去上清，收集細(xì)菌。加入30 μL 的DNA 提取液，吹打混勻，100℃加熱10 min，冷卻后10 000 r/min 離心5 min，離心機(jī)半徑9.5 cm，上清液即為含有DNA 溶液。

1.4 生物被膜表型分析

生物被膜形成能力的檢測參照Vuong 等[4]的報(bào)道，接種于液體LB 培養(yǎng)基中，通過37℃，220 r/min 振搖培養(yǎng)20 h，用含0.25%葡萄糖的TSB 培養(yǎng)基于1∶200 稀釋配置成試驗(yàn)菌液，每孔200 μL 接種于96孔培養(yǎng)板，每個(gè)菌株重復(fù)8 孔，以空白TSB 培養(yǎng)基為對照，置于37℃培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)48 h 后，棄菌液，每孔每次加入200 μL 超純水，洗3 次，60℃干燥1 h，配制0.1%結(jié)晶紫溶液每孔加入200 μL 染色10 min，每孔每次加入200 μL 超純水，洗3 次，去除未結(jié)合的染料，60℃干燥1 h，每孔加入5%乙酸溶液200 μL，溶解染料。在波長為570 nm 處，通過酶標(biāo)儀測定吸光度，將每個(gè)菌株的平均吸光度值用于計(jì)算。生物被膜形成陽性株的篩選條件為：將標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC12228）的平均值A(chǔ)+3 倍標(biāo)準(zhǔn)差定義為界定值，如菌株的平均值A(chǔ)＞界定值則認(rèn)為生物被膜陽性。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)Fredheim 等[5]的研究結(jié)果，SE 具有esp 特異基因，進(jìn)一步通過分子生物學(xué)鑒定臨床菌株的有效性。

1.6 agr 基因多態(tài)性分析

根據(jù)Lina 等[6]的研究報(bào)道，通過多重PCR 對菌株進(jìn)行agr 基因多態(tài)性分型。agr 分型所涉及的引物序列、PCR 產(chǎn)物長度等相關(guān)信息見表1。PCR 反應(yīng)體系包含上下游引物10 μmol/L 各0.1 μL，2×Taq PCR Master Mixture 10 μL，細(xì)菌模板DNA 2 μL，加ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，30 個(gè)循環(huán)（94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min），最后72℃充分延伸10 min。

表1 研究中用到的引物序列及PCR 實(shí)驗(yàn)

2 結(jié)果

2.1 分子生物學(xué)鑒定SE

臨床分離血液來源的SE 共81 株，無重復(fù)菌株，所有菌株通過PCR 擴(kuò)增為esp 陽性。部分PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 8 株臨床分離的血液來源的SE 的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.2 血液來源的SE 生物被膜形成能力

通過半定量黏附試驗(yàn)檢測臨床分離血液來源的SE 菌株的生物被膜形成能力。以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-12228 為陰性對照，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984 為陽性對照，部分分析結(jié)果見圖2。ATCC12228 標(biāo)準(zhǔn)菌株的A 值為（0.28±0.01），則定義界定值為0.33，菌株A 值＞界定值則為生物被膜形成陽性菌株。根據(jù)半定量黏附試驗(yàn)結(jié)果，81 株SE 中，共有54 株陽性，占66.67%。

圖2 生物被膜形成能力檢測

2.3 agr 基因多態(tài)性分析

通過多重PCR 分析5 個(gè)菌株agr 基因多態(tài)性，PCR 產(chǎn)物經(jīng)的凝膠電泳結(jié)果見圖3。臨床分離血液來源的81 株SE 中，agr I 型51 株（62.96%），agr Ⅱ型6 株（7.41%），agr Ⅲ型7 株（8.64%），agr 未分型17 株（20.99%）。

圖3 5 株SE 的agr 多態(tài)性分析結(jié)果

3 討論

根據(jù)2017 年中國細(xì)菌耐藥檢測（CHINET）數(shù)據(jù)顯示，80.3%的凝固酶陰性葡萄球菌為甲氧西林耐藥株，且表現(xiàn)為對絕大多數(shù)測試藥物耐藥[7]。SE 是最主要的凝固酶陰性葡萄球菌，近年來隨著中心靜脈導(dǎo)管、人工關(guān)節(jié)、人工心臟起搏器和人工心臟瓣膜等介入性醫(yī)療設(shè)施的臨床廣泛使用，生物被膜相關(guān)性感染越來越受到人們重視[8]。SE 的最主要的致病機(jī)制是在植入的醫(yī)療設(shè)備上形成生物被膜，生物膜中的細(xì)菌對抗生素的抵抗力是浮游細(xì)胞的500～1000 倍[9]。這將導(dǎo)致感染呈復(fù)發(fā)性或難治性，治療失敗[10]。SE 的生物被膜形成及相關(guān)感染已引起臨床高度重視，也給臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。

SE 的agr 在生物被膜形成過程中起中心調(diào)節(jié)作用，是SE 最為重要的毒力因調(diào)節(jié)系統(tǒng)[11]。agr 是SE 最重要的群體感應(yīng)系統(tǒng)，能調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通訊和細(xì)菌的定殖，介導(dǎo)SE 毒力因子的表達(dá)，與SE 的侵襲性和生物被膜中細(xì)菌的再傳播性密切相關(guān)。Dai 等[3]研究結(jié)果提示，抑制agr 表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞自溶，生物被膜分散，使得生物被膜中的細(xì)菌擴(kuò)散，最終促進(jìn)新生物膜的形成。Patel 等[12]通過分析SE 的分子特征和生物被膜形成發(fā)現(xiàn)，agr 可能是SE 致病力的一個(gè)重要分子標(biāo)記。Dufour 等[13]通過基因序列分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)SE 一般可分三型（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型），但agr 不同基因型之間的相互作用，還有待進(jìn)一步研究[14-15]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)致病菌和非致病菌的agr 型別不同，臨床致病的SE 以agr Ⅰ型為主，而皮膚表面分離的正常SE 以agr Ⅱ型為主，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)具有大約15%的SE 有agr 自然突變。Hellmark 等[17]研究結(jié)果提示，導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)感染的SE 主要是agr Ⅰ型和agr Ⅲ型。唐光敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)臨床分離的金黃色葡萄球菌以agr Ⅰ型為主。但是，對于導(dǎo)致血流感染的SE 研究較少。本研究以血液來源的SE 為研究對象，分析菌株agr 多態(tài)性，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)81 株臨床分離的SE 中，agrⅠ型51 株（62.96%），agr Ⅱ型6 株（7.41%），agr Ⅲ型7 株（8.64%），agr 未分型17 株（20.99%）。提示血液來源SE 以agr Ⅰ型為主，agr 未分型較普遍。結(jié)果中agr未分型菌株為17 株，這可能是agr 自然突變導(dǎo)致。多種細(xì)菌和宿主因素等可影響agr 系統(tǒng)的活性，這些因素對葡萄球菌造成了巨大的選擇壓力，細(xì)菌可通過agr位點(diǎn)突變來應(yīng)對這種選擇[19]。Vuong 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，agr突變的SE 菌株，其生物膜的形成能力和初始黏附能力均增強(qiáng)。因此，進(jìn)一步研究17 株agr 未分型菌株的分子生物學(xué)特征和生物被膜的形成能力是非常有意義的課題。

本研究通過分析臨床分離血液來源SE 的agr 多態(tài)性，為了解臨床分離血液來源SE 的分子特征與生物被膜形成奠定了基礎(chǔ)。臨床分離血液來源SE 具有較高的生物被膜形成能力，提示具備強(qiáng)致病率和院內(nèi)感染率，應(yīng)引起臨床重視。進(jìn)一步分析了臨床分離血液來源的SE 的生物被膜形成能力，發(fā)現(xiàn)81 株SE 中，有54 株生物被膜形成陽性，占66.67%。提示臨床血液來源的SE 中有很強(qiáng)的生物被膜形成能力，即致病能力。近年來，研究發(fā)現(xiàn)生物被膜的主要包含多糖細(xì)胞間黏附素、細(xì)胞錨定蛋白和胞外DNA 3 種組成，這3 種成分在生物被膜形成中具有重要作用[20-23]。在下一步的研究中，我們將進(jìn)一步研究臨床SE 的生物被膜形成機(jī)制。