豐富環境對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬神經元凋亡及腦源性神經營養因子/酪氨酸蛋白激酶受體信號通路的影響

趙彬，唐強，朱路文，王艷，梁碧瑩

1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱市 150001；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱市 150040

圍產期缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是新生兒死亡的主要原因，存活下來的新生兒也往往遺留運動障礙、認知障礙和癲癇等神經系統后遺癥，給家庭和社會造成極大負擔[1]。據國外統計[2]，一半以上的患兒存在神經系統功能障礙。越早對HIBD 患兒進行治療，其中樞神經系統功能障礙嚴重程度越低，患兒的運動和認知功能也會越早提高[3]。

早期干預中，豐富環境刺激最為常見和有效，包括視聽覺刺激和嬰兒撫觸。美國Hebb[4]最早對豐富環境進行報道，此后在動物神經可塑性領域被大量研究和應用。在形態學(如腦皮質厚度的變化)，神經網絡的重建，神經元及其樹突、軸突再生，新突觸連接形成和重塑等方面，豐富環境對非新生動物起顯著作用[5]。近幾年研究發現[6-10]，豐富環境對HIBD 的運動、記憶能力和空間認知等都有改善作用，同時海馬CA1區微管相關蛋白(microtubule-associated protein-2,MAP-2)陽性細胞和成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)表達增加，還增加海馬區樹突棘的密度，促進內源性血管生成。已有研究提出[11-12]，損傷后發揮神經元的保護作用，防止神經元的變性和壞死與腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)/酪氨酸蛋白激酶受體(tyrosine kinase receptor B,TrkB)信號通路相關。HIBD 發生后細胞變性壞死主要是通過細胞凋亡的形式發生，因此對細胞凋亡的通路和機制進行研究，找到抗凋亡的新方法成為目前研究的關鍵問題。

本實驗通過建立HIBD 大鼠模型，探討豐富環境對海馬神經元凋亡及BDNF/TrkB信號通路的影響，并探討可能作用機制，為臨床HIBD 治療提供有力證據和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

48 只7 日齡新生Wistar 大鼠幼仔，體質量(12.5±0.7)g，雌雄比例1∶1，按照科技部《實驗動物管理條例》進行飼養。將大鼠按照隨機數字表法分為模型組、假手術組和豐富環境組，每組再分為14 d、28 d兩個亞組，每個亞組8只。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑

水合氯醛：天津光復科技發展有限公司。4%多聚甲醛：武漢博士德公司。濃縮型BDA 試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司。蛋白酶k：上海如吉生物技術有限公司。BDNF 一抗：沈陽萬類生物科技有限公司。TrkB一抗：武漢博士德公司。一抗二抗去除液：上海碧云天生物技術有限公司。PVDF 膜：美國MILLIPORE 公司。脫脂奶粉：伊利。兔抗大鼠多克隆抗體：北京博奧森公司。

1.2.2 儀器

RM2265 型全自動輪轉式切片機：德國LEICA 公司。Eppendorf Researchplus 移液器：德國EPPENDORF 公司。H-2050R 型超高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。CX31 型生物顯微鏡：日本OLYMPUS 公司。W1OLVF 超純水系統：香港HEALFORCE 公司。DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒儀器有限公司。8%O2+92%N2混合氣體：哈爾濱黎明氣體集團。

1.3 模型制作

新生大鼠HIBD 模型制備采用Rice-vannucci 經典方法，新生Wistar 大鼠10%水合氯醛0.3 g/kg 麻醉，常規消毒后頸正中切口，將左側頸總動脈分離，永久性結扎，對合皮膚后縫合。術后2 h 置于含8%O2+92%N2有機玻璃缺氧箱中缺氧2 h，同時記錄新生鼠一般行為。大鼠出現夾尾尖叫或者自發向左轉圈，說明模型制備成功，將其重新放回籠中繼續由母鼠進行母乳喂養。

假手術組僅分離左側頸總動脈，不進行結扎和缺氧，隨后放入原籠中母乳喂養。

1.4 建立豐富環境刺激模型

制作70×60×50 cm 的透明玻璃環境[13]。此環境中擺放不同顏色、氣味和形狀的物品，包括各種質感的紗布、刷子，低溫物品和有刺激性氣味的菠蘿干、榴蓮球等，還有積木、塑料通道、樓梯、繩子、蹺蹺板、松土盒、玻璃球等“玩具”，同時用紅色燈光刺激活動區，在玻璃籠中用音樂盒播放音樂進行聲音刺激，考慮到大鼠的晝息夜出習慣、生存溫度、攝食等因素，3 d后對環境進行重新布置。

1.5 干預方法

假手術組和模型組術后24 h 置于無任何刺激籠中飼養，保持籠中清潔，大鼠正常攝食、飲水等，予以同等條件抓取。

術后24 h，豐富環境組每天與母鼠分離4 次，每次30 min，放入豐富環境籠，進行早期撫觸和視聽覺刺激，氣味和不同溫度刺激。

1.6 檢測

各組于造模后14 d、28 d，10%水合氯醛0.3 g/kg麻醉后，常規消毒腹腔開口，破壞膈肌造成氣胸，暴露心臟，右心耳開口，將0.9%氯化鈉注射液100 ml及4%多聚甲醛溶液灌入，觀察肺部和肝臟呈現白色，期間大鼠可出現四肢抽搐最后僵直狀態。迅速切頭后取腦，分離海馬，將分離的海馬浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，48 h 后乙醇脫水，常規石蠟包埋，冠狀切片，厚3～5 μm。

1.6.1 TUNEL法

每只大鼠隨機選取5 張切片，烤片、脫蠟、乙醇水合后，蛋白酶k 常溫下消化30 min，PBS 漂洗液3次，加入TUNEL 反應液，37 ℃暗溫盒中放置60 min。熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。蘇木素復染、返藍、乙醇脫水、二甲苯透明封片、鏡檢、拍照。每張切片選取5 個不重復視野，顯微鏡下計數TUNEL 陽性神經元，取均數。

1.6.2 雙重免疫熒光染色法

每只大鼠隨機選取5 張切片，脫蠟、水化、抗原修復后，常溫下PBS 和FBS 封存后，滴加兔抗大鼠切割半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)多克隆抗體(美國SANTA BIOTECHNOLOGY 公司)和大鼠抗神經元特異性核蛋白抗體(1∶1000，美國CHEMICON公司)，保濕盒中4 ℃孵育12 h，PBS 洗滌3 次，滴加二抗(上海碧云天公司)室溫下孵育1 h，PBS 洗滌3 次，干燥過夜封片。每張切片取5 個不重復視野，正置熒光顯微鏡觀察，拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

1.6.3 免疫組化法

每只大鼠取5 張切片，60 ℃烤干、脫蠟入水，內源性過氧化物酶活性3% H2O2溶液滅活，滴加一抗(BDNF 或TrkB)，4 ℃過夜(陰性對照用PBS 代替)，隔日以室溫恢復，滴加生物素化二抗工作液，37 ℃孵育10～15 min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～15 min；DAB 顯色，蘇木素復染，分化、返藍、脫水、干燥，封片并拍照記錄。CX31 型顯微鏡下觀察，陽性以棕黃色或棕褐色呈現，陰性細胞以藍色呈現。每張切片取5 個不重復視野，記錄視野內BDNF、TrkB陽性細胞數，取平均值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 19.0 軟件包進行統計學分析。計量資料以(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 海馬神經元凋亡

2.1.1 TUNEL法

造模后14 d、28 d，與假手術組比較，模型組海馬區TUNEL 陽性細胞數顯著增加(P<0.001)；與模型組比較，豐富環境組海馬區TUNEL 陽性細胞數顯著減少(P<0.001)。見圖1、表1。

2.1.2 雙重免疫熒光染色

造模后14 d、28 d，與假手術組比較，模型組雙標記陽性細胞數顯著增加(P<0.001)；與模型組比較，豐富環境組雙標記陽性細胞數顯著減少(P<0.001)。見圖2、表2。

2.2 海馬BDNF表達

造模后14 d、28 d 后，假手術組海馬BDNF 陽性細胞表達不明顯；與假手術組比較，模型組海馬BDNF 陽性細胞表達顯著增高(P<0.001)；與模型組比較，造模后28 d，豐富環境組海馬BDNF 陽性細胞表達顯著增加(P<0.001)。見圖3、表3。

表1 各組造模后14 d、28 d后海馬區TUNEL陽性細胞數(n/視野)

圖1 各組造模后海馬區細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

圖2 各組造模后神經元表達(雙重免疫熒光染色，×800，bar=100 μm)

表2 各組造模14 d、28 d后海馬區雙重免疫熒光染色陽性細胞數(n/視野)

表3 各組造模14 d和28 d后海馬BDNF陽性細胞計數(n/視野)

2.3 海馬TrkB表達

造模后14 d、28 d，假手術組海馬TrkB 陽性細胞表達不明顯；與假手術組比較，模型組海馬TrkB 陽性細胞表達顯著增高(P<0.001)；與模型組比較，造模后28 d，豐富環境組海馬TrkB 陽性細胞顯著增加(P<0.001)。見圖4、表4。

表4 各組造模14 d和28 d后海馬TrkB陽性細胞計數(n/視野)

3 討論

新生兒HIBD 主要由圍產期宮內病理因素和窒息引起，可以造成新生兒死亡和神經系統后遺癥[13]。豐富環境刺激通過顏色視覺刺激，接觸物觸覺刺激，滾筒、臺階、秋千等的平衡刺激，促進神經元發育，提高認知功能[14]。豐富環境干預不僅可以使神經突觸可塑性增強，還可以調控營養因子和再生因子濃度[15-16]，其中BDNF激活釋放以及與特異性受體TrkB結合使神經再生，細胞間突觸重建或重組，減輕腦損傷[17]。當TrkB 與BDNF特異性結合后，激活產生復合物，產生某些小G 蛋白，包括Ras 蛋白和Rap-1 等[18]。李亞琴等[19]研究發現，靜脈注射BDNF 后HIBD 小鼠腦內TrkB mRNA 和蛋白表達明顯增強，對腦內神經細胞的保護和修復作用明顯強化。相關報道表明[20-21]，BDNF 在各種原因導致的缺氧缺血后可以避免神經元凋亡，預實驗顯示當給予TrkB 受體的選擇性激動劑29d7 處理后神經元的存活能力顯著增加。當BDNF 與全長型的TrkB 受體結合，BDNF/TrkB 信號通路才能被激活，BDNF/TrkB 信號通路激活后可以改善神經功能，減少梗死體積以及修復受損神經元[22]。本研究發現，造模28 d后，豐富環境組海馬BDNF和TrkB表達高于模型組。

圖3 各組大鼠海馬區BDNF細胞表達(免疫組化染色，×400)

圖4 各組大鼠海馬區Trkb細胞表達(免疫組化染色，×400)

細胞凋亡是由基因調控的一系列介導、調控并且有程序性和主動性細胞死亡過程。凋亡和調控的對抗決定細胞最終的結果。在有限的“時間窗”內有效調控細胞的凋亡信號能大大保留神經功能。徐曉虹等[23]研究發現，豐富環境干預可抑制腦缺血后神經細胞凋亡，抵抗缺血再灌注損傷，認為豐富環境是抗細胞凋亡、改善腦功能的一條有效途徑。本實驗應用TUNEL 法和雙重熒光染色對神經元內細胞凋亡標記物cleaved caspase-3 和成熟神經元標記物NeuN 進行標記，結果顯示，各時間點豐富環境組雙標記陽性細胞數少于模型組。說明細胞凋亡主要發生在神經元內，豐富環境是通過調控海馬區神經細胞凋亡來抑制腦組織損傷。

綜上所述，豐富環境在新生兒HIBD 后上調BDNF、TrkB 蛋白的表達，抑制海馬區細胞凋亡，發揮保護、修復腦內神經細胞，抑制細胞凋亡，改善腦功能的作用。但新生兒HIBD 是個復雜的過程，其下游通路和信號及蛋白表達還需進一步探究。