電針夾脊穴和足陽明胃經穴對脊髓損傷大鼠下肢神經功能恢復和突觸素I的影響比較

吳俏鋒，周賓賓，魏衛兵，覃鏡羽，馮振奮，李建男

1.廣西中醫藥大學，廣西南寧市 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西南寧市 530023

脊髓損傷具有致殘率高、康復難和病程長的特點，治療和康復產生的高費用為患者家庭帶來嚴重負擔。如何促進脊髓損傷后神經功能恢復及突觸再生為近年來的研究熱點[1]。

中醫在脊髓損傷的康復和治療中有著獨到的優勢，其中針灸基于深厚的經絡理論，在促進神經功能恢復及緩解并發癥上有著可觀的效果[2-4]。由于脊髓的解剖位置和功能與中醫督脈高度相似，現代中醫臨床有“脊柱損傷即督脈損傷”之說[5]。脊髓損傷后其損傷平面以下運動神經功能障礙的癥狀，可歸于傳統醫學中“痿癥”的范疇。基于《內經》“治痿獨取陽明”的理論，臨床對于脊髓損傷的針灸研究多為陽明經穴干預實踐，但缺乏相關實驗研究。

Synapsin I 作為只存在于突觸前囊泡膜上的特異性蛋白，對囊泡運輸、神經遞質的釋放和突觸的可塑性具有重要的意義[6-7]，其分布和表達可反映神經元突觸的功能[8-9]。

本研究擬建立缺血損傷型大鼠脊髓損傷模型，通過BBB評分評價不同時間點大鼠脊髓損傷后神經功能情況，比較電針夾脊穴和足陽明胃經對脊髓損傷大鼠神經功能恢復的影響，并檢測不同時間點脊髓損傷部位Synapsin I 的mRNA 和蛋白水平，以驗證“治痿獨取陽明”。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雌性SPF 級Sprague-Dawley 大鼠60 只，體質量180～220 g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號SCXKX-2014-0002。實驗過程中嚴格遵守動物福利與倫理準則和指南的相關規定。

1.2 主要儀器和試劑

SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×)：碧云天，貨號P0015L。PMSF：碧云天，貨號ST506。RIPE 蛋白裂解液：索萊寶，貨號R0020。Trizol：大連寶生物，貨號9109。SYBR Green mix：南京諾維贊，貨號Q111-01。反轉錄試劑盒：FERMENTAS 公司，貨號K1622。Synapsin I一抗：博士德生物，貨號BA1421，75 kDa。Tanon-4200 全自動化學發光圖像分析系統。電泳儀：北京六一。半干轉膜儀：日本ATTO。ABI7500熒光定量PCR儀。

1.3 造模

根據課題組前期研究的結果[10-12]，采用缺血損傷型造模方法，對實驗大鼠T10椎板切除后采用血管鉗鉗夾脊髓的方法進行造模。10%水合氯醛3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后術區備皮，俯臥位固定于手術臺上，術區碘伏常規消毒。以T10棘突為中心切開皮膚約3 cm，分離皮下筋膜及椎旁肌肉，暴露T9～T11棘突及椎板，修剪棘間韌帶，用眼科鑷夾持T10棘突輕輕上提，擴大T10～T11椎體間隙后，以12 cm 持針器經擴大的椎體間隙與脊髓平行咬除椎板，暴露硬脊膜。用血管夾(夾力約60 g)穿過脊髓椎體之間，鉗夾脊髓30 s 導致T10脊髓缺血損傷。輕柔打開抽出血管夾，溫鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉、筋膜及皮膚。術后前3 d 每天皮下注射20 萬U 青霉素鈉預防感染，每日定期膀胱壓迫排尿2次。

造模成功標準：①閉合血管夾后脊髓表面迅速滲出暗紅色血液，同時可見下肢抽搐及尾巴左右擺動；②術后第1 天可見大鼠雙下肢功能完全喪失，肌力0級，雙下肢拖行移動，BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分[13]均為0。

1.4 分組

造模成功后，將每只大鼠編號，根據Excel 生成的隨機號碼分為對照組、夾脊穴電針組(夾脊組)和足陽明胃經電針組(陽明組)，每組20 只，均于造模成功3 d 后開始干預。分別于干預后第1 周、2 周、3 周、4周和5 周結束時取材，每個時間點4 只大鼠。自干預起，每天按BBB評分標準對大鼠進行行為功能評估并記錄。

1.5 干預

參照全國針灸協會實驗針灸研究會制定的《實驗動物針灸穴位圖譜》，選穴方法：①對照組造模后不做干預；②夾脊組選取后背T9和T11椎體棘突平面夾脊穴；③陽明組選擇雙側伏兔、足三里穴。

以上每個穴位各刺入一根毫針，穿皮后再進針約2 mm，刺激強度12～15 mV(C6805-I 型電針治療儀)，刺激頻率2 Hz，疏密波，留針30 min。工作日每天1次，連續5周。

1.6 灌注、固定和樣本采集

每組大鼠于相應干預時間，以10%水合氯醛0.35 ml/100 g 腹腔注射，麻醉后固定于手術臺上，用手術剪剪開胸腔暴露心臟，于心間處穿入灌胃針至升主動脈，并用止血鉗將灌胃針與心尖固定，剪開右心耳后，0.9%氯化鈉溶液灌注至大鼠眼睛、肝臟等顏色變淡，且右心耳流出液體清徹。

每個亞組取1 只大鼠4%多聚甲醛溶液繼續灌注，待大鼠四肢、尾部和軀干僵硬后停止。處死后用手術剪分離出損傷部分脊柱，小心取出以損傷點為中心長約1 cm 的脊髓組織，浸入4%多聚甲醛溶液中固定，行病理切片用于HE 染色和免疫組化染色。每個亞組剩余3 只大鼠取損傷脊髓標本保存于液氮中，用于行Western blotting 和逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)。

1.7 檢測

取1 份標本石蠟包埋后，切成5 μm 的石蠟切片，50 ℃溫水中展片、貼片后，放于60 ℃恒溫箱內烤片2 h備用。

1.7.1 HE染色

取上述標本經過蘇木素染色5 min；鹽酸乙醇分化5 s；自來水返藍15 min；伊紅染色5 min；95%乙醇快速清洗2 min，共2次；無水乙醇快速脫水；二甲苯透明5 min，共3次；樹膠封片；鏡檢拍照。

1.7.2 免疫組化染色

取上述標本經過檸檬酸鈉高壓抗壓修復，3%H2O2溶液室溫孵育以消除內源性過氧化物酶的活性，滴加Synapsin I 多克隆抗體工作液，Synapsin I 抗體稀釋液(稀釋濃度1∶85)50 μl，置于濕盒中孵育2 h；室溫下滴加二抗，DAB 顯色，顯微鏡下觀察，陽性顯色為棕黃色、棕色或棕褐色；經復染、脫色、反藍、脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察。

Synapsin I 染色以細胞質中出現明顯黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色，染色結果根據免疫組化半定量評分標準[14]。高倍鏡(×400)下對每張切片任意選5 個視野，計數200個細胞/視野，共計1000個細胞，觀察其陽性細胞表達強度。A 為陽性細胞數分級，0%～1%=0，1%～10%=1，10%～50%=2，50%～80%=3，80%～100%=4；B 為陽性細胞顯色強度分級，陰性=0，弱陽性=1，陽性=2，強陽性=3。免疫組化評分(immunohistochemical scores,IHS)=A×B[14]。

1.7.3 RT-qPCR

取上述液氮保存組織(每份標本50～100 mg)，用Trizol 提取總RNA，紫外分析測定所抽提RNA 的濃度。使用反轉錄試劑盒將1 μg RNA 反轉錄成cDNA。使用熒光定量PCR 儀進行cDNA 擴增與檢測，反應條件：95 ℃120 s，循環40 次，95 ℃15，60 ℃20 s，72 ℃20 s。

設計合成Synapsin I 引物序列：上游引物5′-GAT GGT TCG ACT ACA CAA-3′，下游引物3′-TCT TCA CAA CTA CAG GGT-5′(擴增片段長度116 bp)。

ATCB 內參序列：上游引物5′-GCT ATG TTG CCC TAG ACT TCG A-3′，下 游 引 物3′-GAT GCC ACA GGA TTC CAT A-CC-5′(擴增片段長度173 bp)。

反應體系：2×SYBR Green Mix 10μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 5 μl，超純水4 μl，采用△△Ct 法進行基因表達的相對定量。

1.7.4 Western blotting

取上述液氮保存的標本，用RIPE 裂解液提取蛋白后進行SDS-PAGE 電泳，上樣后經電泳、轉膜、封閉后加1∶400 Synapsin I 蛋白稀釋抗體4 ℃孵育過夜，次日用含5% 脫脂奶粉的TBST 溶液稀釋二抗(1∶3000)，室溫孵育后，曝光并拍照記錄。用軟件分析圖像，以β-actin 蛋白作為內參，以Synapsin I 蛋白與內參的比值作為相對表達量。

1.8 統計學分析

采用SPSS 17.0 進行統計分析。計量結果以(xˉ±s)表示。多樣本間比較用單因素方差分析，方差齊性時，采用LSD檢驗；方差不齊時，采用Dunnett's T3檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 BBB評分

夾脊組和陽明組術后1～5 周BBB 評分均高于對照組(P<0.05)。陽明組1～3 周BBB 評分高于夾脊組(P<0.05)，4～5 周兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2 HE染色

對照組1～2周時脊髓結構極度紊亂，神經元消失，部分髓鞘脫失，中度炎細胞浸潤；隨著時間延長逐漸好轉；5 周時脊髓結構輕微紊亂，神經元數量明顯增多，無髓鞘脫失，偶有炎細胞浸潤，無明顯出血。陽明組1 周時脊髓灰質區中度炎細胞浸潤，毛細血管數量增多，結構稍紊亂；后逐漸好轉，5 周時可見炎性細胞浸潤明顯減輕，神經元數量明顯增多。夾脊組1周時脊髓灰質區中度炎細胞浸潤，毛細血管數量增多，有輕微出血，有少量脂肪滴脊髓結構稍紊亂；后逐漸好轉，5 周時可見輕度炎細胞浸潤，神經元數量增多。見圖1。

2.3 免疫組化染色

Synapsin I 蛋白陽性表達位于細胞膜和細胞漿內，第1 周起，蛋白陽性表達逐漸增強；第3 周時，陽性表達最高；從4周開始，陽性表達逐漸降低。見圖2。

夾脊組1 周時Synapsin I 蛋白IHS 高于對照組(P<0.05)，陽明組1～4 周均高于對照組(P<0.05)。陽明組3～4周時SynapsinI蛋白IHS高于夾脊組(P<0.05)。見表2。

2.4 RT-qPCR

對照組Synapsin I mRNA 表達隨著時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，4周時達到高峰，5周開始降低。夾脊組1 周時Synapsin I mRNA 表達高于對照組(P<0.05)，陽明組1～4 周均高于對照組(P<0.05)。陽明組3 周時Synapsin I mRNA 表達高于夾脊組(P<0.05)。見表3。

表1 各組不同時間點BBB評分比較

表2 各組Synapsin I蛋白IHS比較

圖1 各組脊髓形態(HE染色，×400)

圖2 各組Synapsin I蛋白表達(免疫組化染色，×400)

表3 各組Synapsin I mRNA表達(△△Ct)

2.5 Western blotting

對照組Synapsin I 蛋白隨著時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，在3 周時達到高峰，3 周后逐漸降低。夾脊組1周時Synapsin I蛋白表達高于對照組，陽明組1～4 周時均高于對照組(P<0.05)。陽明組Synapsin I蛋白表達2～3周高于夾脊組。見圖3、表4。

3 討論

脊髓損傷后早期手術能有效緩解繼發性損傷[15]，中后期則是漫長的康復治療。針灸作為中醫特色療法之一，具有促進神經功能康復、緩解并發癥等獨特的優勢[16]。臨床上治療脊髓損傷選穴主要以督脈和足陽明胃經為主，然而對于脊髓損傷電針干預的動物實驗研究多為督脈或夾脊穴。

圖3 各組脊髓損傷部位Synapsin I蛋白條帶圖(Western blotting)

表4 各組Synapsin I蛋白表達(/β-actin)

鄒恩苗等[17]對48 只Sprague-Dawley 大鼠電針督脈和夾脊穴后觀察7 d，發現白細胞介素(interleukin,IL)-lβ、IL-6 下調，IL-10 上調。李曉寧等[18]發現電針夾脊穴能夠改善脊髓損傷大鼠運動功能，可能與抑制NLRP3 炎癥小體過度活化、降低caspase-1 表達有關。還有研究發現[19]，電針夾脊穴可抑制損傷局部Ras 同源基因Rho 相關螺旋卷曲蛋白激酶(Ras homologous gene/a Rho-associated coiled coil-forming protein kinase,Rho-ROCK)Ⅱ信號通路RhoA、ROCKⅡ、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)的表達。劉鵬民等[20]觀察到督脈電針具有上調生長相關蛋白(growth associated protein,GAP)-43、抑制Nogo-A 的作用。Tu等[3]發現督脈電針可以上調損傷局部脊髓腦源性神經生長因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神經營養因子(neurotrophin-3,NT-3)的水平，且跨損傷部位的大椎、命門穴電針效果較損傷截面以上的百會、風府穴要好。Mo 等[21]更是觀察到神經元數量增多的現象。

可見基于“督脈論治脊髓”理論，電針督脈或夾脊穴對脊髓損傷大鼠下肢神經功能恢復具有促進的作用，同時還兼具減輕炎癥反應、抑制神經細胞凋亡、促進突觸再生、緩解脊髓損傷并發癥等眾多效果。

然而中醫素有“同病異治”的觀點，脊髓損傷表現為下肢運動功能障礙，可歸屬于中醫“痿癥”的范疇，《內經》有“治痿獨取陽明”的理論詮釋，但是缺乏實驗研究證明。《素問·痿論》中“陽明者，五臟六腑之海……而陽明為之長，皆屬于帶脈，而絡于督脈，故陽明虛則宗筋骨縱，帶脈不引，故足不用也”也闡述了足陽明胃經與督脈和痿癥的關系。基于此理論，夏士濤等[22]電針足陽明胃經治療脊髓損傷也取得較好的效果。

本實驗觀察對比電針夾脊穴和足陽明胃經穴對脊髓損傷后大鼠神經功能的影響。選擇足三里作為足陽明胃經合穴，具有遠治調理脾胃，補益氣血的功效，符合“治痿獨取陽明”的理論要求，伏兔同屬足陽明胃經，為臨床治療下肢癱瘓的常用穴，故選為配穴。《華佗別傳》“又有人病腳躄不能行，……后灸愈。灸處夾脊一寸上下行，端直均調如引繩也”指出夾脊穴對于下肢功能障礙的治療作用，選取損傷部位附近夾脊穴作為本實驗研究對象主要取其近治行氣活血的功效[17-18]。

Synapsin I 最早被發現于1985 年，是一種與神經生長、修復再生和突觸重塑密切相關的Ca2+敏感蛋白[23]，廣泛存在于突觸前膜中，其水平被認為是神經遞質釋放、神經元之間突觸強度的重要指標而應用于神經功能研究中[9]。其對突觸小泡的作用在于去磷酸化的狀態下與突觸小泡結合，磷酸化后從囊泡中解離，最終允許神經遞質的胞吐作用[24]。而神經遞質作為突觸間傳遞的主要介質，Synapsin I 蛋白可反映突觸胞吐的能力[25-26]。另有研究表明[27-28]，Synapsin I 在分布和數量上與突觸的數量和密度具有相關性，可作為觀察突觸密度和分布的指標。此外，Synapsin I 對于突觸的形態結構也尤為重要[29]。神經再生主要與突觸的重塑有關，因此，Synapsin I 的表達量和密度分布等可作為反映神經功能的特異標志物。

本研究中，脊髓損傷后所有大鼠均出現典型的雙后肢癱瘓，術后10 d 大鼠的后肢運動功能逐漸開始有不同程度的改善，電針干預對后肢運動功能恢復作用明顯，BBB 評分要優于對照組。對照組BBB 評分在經過一段低水平分值后開始逐漸上升，夾脊組1 周即出現神經功能改善，陽明組改善更佳。RT-qPCR 結果顯示，術后Synapsin I mRNA表達先上升后下降，4周時達到高峰。夾脊組Synapsin I mRNA 表達總體高于對照組，但是只有1 周時有顯著性差異，陽明組1～4周均優于對照組。Western blotting 結果顯示，對照組Synapsin I蛋白改變峰值相對mRNA 提前，3周時就已達到高峰，改變趨勢接近BBB評分，可能與脊髓損傷后早期局部炎癥、缺血條件未能得到改善，神經元代謝和蛋白降解功能受影響有關[30]。HE 染色也可見3周后炎性細胞浸潤改善；夾脊組Synapsin I 蛋白水平提高，但是只有1 周時有顯著性差異，陽明組1～4 周均優于對照組。另有研究表明，大鼠脊髓損傷后輔助運動或自由運動均對脊髓損傷康復具有促進作用[31-32]，本研究中陽明組電針時也可見大鼠雙下肢肌肉收縮，可能由于此原因，Synapsin I蛋白量5周時組間無顯著性差異。

綜上所述，本研究結果提示，經過缺血損傷型造模后，脊髓損傷大鼠下肢神經功能具有可逆自行恢復的現象。電針夾脊穴和足陽明胃經可以促進脊髓損傷大鼠下肢神經功能的恢復，體現電針的促進修復效能和“治痿獨取陽明”的微弱優勢，同時也顯現了中醫“同病異治”的臨床特點。

本文作為電針足陽明胃經對脊髓損傷后神經康復的初步探索，為臨床治療脊髓損傷選穴提供實驗證據。但由于實驗樣本數不多或存其他調控及偏倚原因，部分數據未能體現出統計學差異，HE 染色提示的炎癥緩解和神經細胞增多也未能定量比較，有待今后進一步研究。電針夾脊穴或督脈治療脊髓損傷已具有多靶點的認識[33]，“治痿獨取陽明”能否擁有更優的效果，亦有待進一步探討。