不同地區茶園土壤硝化潛勢特征研究

牛司耘，倪康，趙晨光，馬立鋒，阮建云

不同地區茶園土壤硝化潛勢特征研究

牛司耘，倪康，趙晨光，馬立鋒*，阮建云

中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

為明確我國茶園土壤硝化潛勢及其主要影響因素，本研究采集了我國亞熱帶地區12個省份的30份代表性茶園土壤，通過懸浮液培養法對土壤硝化潛勢進行了研究，并利用多元回歸和偏最小二乘回歸（PLS）等統計分析方法，明確了影響其變化的主效應因子。結果顯示，茶園土壤硝化潛勢在0.24~5.31?mg·kg-1·h-1之間；土壤氨氧化古菌（AOA）與氨氧化細菌（AOB）均與土壤硝化潛勢具有顯著正相關性。PLS分析顯示，AOA、AOB、碳氮比、硝態氮、銨態氮、全氮、有機碳含量是影響土壤硝化潛勢差異的關鍵因子，相對重要性大小依次降低。上述結果表明酸性茶園土壤仍然具有較強的硝化潛勢，AOA可能是酸性茶園土壤氨氧化過程的主導微生物，而因氣候、土壤、栽培方式不同所導致的氨氧化微生物、土壤碳氮有效性高低可能是導致茶園土壤硝化潛勢差異的主要原因。

茶園土壤；硝化潛勢；氨氧化微生物；土壤性質

中國是全球茶樹種植面積最大的國家，約占全球茶園面積的三分之二[1]。氮是茶樹生長發育重要的營養元素，為穩定茶葉產量與品質，茶園氮肥用量通常高于谷類作物，但因較低的收獲指數（只采摘新梢），其氮素利用率不足20%[2]，而未被吸收利用的氮素，會通過淋溶、反硝化、徑流等途徑進入環境系統，增加陸地、水生生態系統中的氮負荷[3]。

土壤硝化作用是肥料氮素進入土壤后參與氮素循環的關鍵過程，受土壤理化性質、環境因子、微生物群落等多種因素影響[4]。因茶樹適宜生長在pH為4.5~5.5的酸性土壤中，喜銨態氮、富集鋁[5]，會增加鐵鋁氧化物在表層土壤的累積，進一步導致土壤酸化。由于酸性土壤條件對氨氧化微生物具有一定的抑制作用，因此一般認為酸性土壤的硝化作用較為微弱[6-8]，而且硝化活性具有很大的空間變異性[9]。但也有研究表明，長期施用氮肥能刺激嗜酸型氨氧化微生物的特異性生長，從而提高酸性土壤的硝化活性[10-13]，增加土壤硝化潛勢。Xue等[14]研究表明，8、50、90齡茶園土壤硝化潛勢有較大差別，但均高于相鄰荒地和森林；Yao等[15]對19個不同茶園土壤硝化潛勢的研究發現，硝化潛勢與AOA豐度、全氮、有機碳含量呈極顯著正相關。目前，多采用懸浮液培養法測定土壤硝化潛勢，其是表征土壤氮素周轉快慢的重要指標，對田間管理措施變化的反應非常敏感，可以多次取樣，能夠快速準確地反映土壤硝化活性。

我國茶樹種植區域廣泛，氣候、土壤類型多樣，其硝化作用具有何種空間差異特征還不清楚。茶園土壤作為典型酸性農田土壤，近年來，其硝化作用成為氮素循環研究的熱點。本研究以不同地區茶園土壤為研究對象，通過評價硝化潛勢，分析硝化活性差異及其影響因素，為指導酸性農田土壤合理施肥和生態可持續發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

30種茶園土壤分別采自12個省份30個地區的長期生產茶園，采樣點基本信息見表1。采樣點在茶行中間，避開施肥區，采用隨機多點混合取樣法，去除土表的凋落物后，采集0~20?cm土層的土壤組成混合樣品，之后去除石礫、根系、植物殘體等雜質，充分混勻，分成3份，1份置于–80℃超低溫冰箱保存，用于提取土壤DNA；1份置于4℃冰箱保存，用于培養試驗；1份風干，用于土壤理化性質分析。

1.2 土壤理化性質的測定

土壤理化性質的測定參考文獻[16]采用常規分析方法，其中土壤pH值用pH計測定（土液比1∶2.5）；有機碳含量采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法（油浴）測定；全氮采用半微量開氏法測定；銨態氮和硝態氮采用MgO-代氏合金蒸餾法；土壤樣品于EHD消解儀中進行硝酸-高氯酸-氫氟酸消解，使用電感耦合等離子體發射光譜法ICP-AES測定全磷、全鉀、全鐵含量；有效態養分元素含量采用Mehlich 3通用浸提劑，電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-AES）測定。

1.3 土壤硝化潛勢的測定

采用懸浮液培養法[17]，稱取15?g新鮮土壤（過10目篩）3份，置于250?mL的三角瓶中，每瓶加入100?mL液體培養基。培養基為1.5?mL 0.2?mol·L-1KH2PO4溶液、3.5?mL 0.2?mol·L-1K2HPO4溶液和15?mL 0.05?mol·L-1(NH4)2SO4溶液的混合溶液，調節pH至7.2。由文獻[15]表明，此條件下土壤硝化能力最強，且茶園土壤不調節pH與調節pH的硝化潛勢有相似的結果和趨勢。

用帶有透氣小孔的塑料膜封住瓶口，置于振蕩培養搖床，在25℃、180?r·min-1下，黑暗培養24?h。培養期間，分別于2、6、12、24?h吸取10?mL土壤懸浮液（用改進的5?mL槍頭，取樣時保持土液比均勻），離心8?000×，10?min，然后取上清液過0.45?μm的濾膜，濾液保存于–20℃，用MgO-代氏合金蒸餾法，測定濾液中NO3--N含量，目前有兩種硝化潛勢計算方法，一是通過線性擬合硝態氮含量與培養時間之間的動態關系，以擬合方程的斜率，即硝態氮含量的增長速率R（mg·L-1·h-1）為硝化潛勢值。另一種是以培養間隔時間段內硝態氮含量變化為依據，以數個間隔內的最大變化量或者平均值作為硝化潛勢值[18]，本研究中，多個土壤的硝態氮含量變化與培養時間明顯不具有線性特征，故采用第二種方法計算茶園土壤硝化潛勢值，由于硝化潛勢最大值更能表征土壤進行硝化作用的最大能力，因此下文分析均基于硝化潛勢最大值。

1.4 土壤DNA提取及熒光定量PCR分析

1.5 統計與分析

因不同樣品間的土壤性質參數呈非正態分布，在進行相關分析前，對數據進行了對數轉換。正態性檢驗方法為Shapiro-Wilk方法。此外，為克服多元線性模型中的多重共線性問題[21]，本研究中采用了偏最小二乘回歸分析（PLS），在普通多元回歸分析（最小二乘法）的基礎上，結合了主成分分析和典型相關分析的思想[22]，考慮了預測變量（因變量）數據中的信息，使自變量和因變量數據提取信息中的相關性達到最大[23]，并通過計算出VIP值（變量投影重要性指標），進行變量篩選，一般95%的置信區間不包括零的變量為顯著變量，以說明自變量在解釋因變量時的重要性，當VIP值大于1，說明自變量在解釋因變量時有更加重要的作用[24-26]。

PLS分析應用SIMCA 13.0完成，其他數據統計與分析通過軟件R3.6.1完成，所有圖采用Sigmaplot 12.5完成。

2 結果與分析

2.1 不同地區茶園土壤的理化性質和氨氧化微生物豐度

供試茶園土壤基本理化性質如表1所示，土壤pH在3.5~5.95，均為酸性土壤。銨態氮和硝態氮含量在不同土壤中差異較大，多數土壤硝態氮含量顯著高于銨態氮。有機碳含量在4.39~69.17?g·kg-1，全氮含量在0.37~5.81?g·kg-1，碳氮比在(8∶1)~(15∶1)，北亞熱帶和南亞熱帶地區的有機碳和全氮含量較多。有效磷含量在土樣間差異較大，其中北亞熱帶地區含量較高。速效鉀含量在28.99~546.33?mg·kg-1，中亞熱帶地區含量較少。南亞熱帶地區全鉀含量低，全鐵和AOB豐度高。有效鐵含量在78.57~573.83?mg·kg-1。所有土壤中，AOA的基因拷貝數均顯著高于AOB，相差最大的達到9.13×106g-1。

2.2 不同土壤硝態氮含量變化和硝化潛勢

在懸浮液培養過程中，所有樣品的硝態氮含量并非均隨時間呈線性增加趨勢。如表2所示，硝態氮含量隨培養時間增加的樣品有19個，占樣品總數的63.33%，其中南亞熱帶地區占21.05%，中亞熱帶地區占42.11%，暖溫帶地區占10.53%，北亞熱帶地區占21.05%；硝態氮含量先增加后降低的樣品有4個，占樣品總數的13.33%，其中包括廣西昭平、廣西三江、云南騰沖3個南亞熱帶地區，江西南昌1個中亞熱帶地區；硝態氮含量先降低后增加的樣品有7個，占樣品總數的23.33%，其中北亞熱帶地區占42.86%，中亞熱帶和南亞熱帶地區占28.57%。

表1 土壤理化性質和氨氧化微生物豐度

本研究中不同茶園土壤硝化潛勢最大值在0.24~5.31?mg·kg-1·h-1，平均值為2.25?mg·kg-1·h-1，不同地區茶園土壤硝化潛勢最大值具有明顯差異，其中小于平均值的部分，即在0.24~＜2.25?mg·kg-1·h-1范圍內（平均值為1.15?mg·kg-1·h-1），18個地區的土壤樣品，占樣品總數的60%，而大于平均值的部分，即在＞2.25~5.31?mg·kg-1·h-1范圍內（平均值為3.9?mg·kg-1·h-1），共12個地區的土壤樣品，占樣品總數的40%。

2.3 茶園土壤硝化潛勢與土壤性質的關系

茶園土壤硝化潛勢與氨氧化古菌、氨氧化細菌豐度呈顯著對數正相關，與其他所測土壤理化性質均無顯著相關性（表3）。氨氧化細菌（AOB）與土壤性質中的有機碳、全氮、速效鉀、全鐵呈顯著對數正相關，而氨氧化古菌（AOA）則僅與AOB具有顯著正相關性，與土壤理化性質無顯著相關性。

表2 培養過程中土壤硝態氮含量變化和硝化潛勢計算值

表3 土壤硝化潛勢與土壤性質的相關性

注：*表示顯著相關（<0.05），**表示極顯著相關（<0.01）

Notes: * represents a significant correlation (<0.05), ** represents a highly significant correlation (<0.01)

如圖1所示，以供試土壤的硝化潛勢為因變量，多個土壤基本性質為自變量，對30個樣品的硝化潛勢進行偏最小二乘回歸分析（PLS），結果顯示茶園土壤性質參數與硝化潛勢密切相關，第一主成分與第二主成分分別解釋了45.2%和42.9%的變異，但茶園土壤性質的地帶性規律不明顯，除南亞熱帶的云南普洱、中亞熱帶的江西上饒偏離聚集區外，其余不同氣候帶出現大范圍重疊，南亞熱帶、中亞熱帶地區硝態氮的3種變化趨勢均存在。VIP值超過1且為顯著變量的有AOA、AOB、碳氮比、硝態氮、銨態氮、全氮、有機碳，其相對重要性大小依次降低（圖2）。

注：3種形狀表示硝態氮的3種變化趨勢，○：升高；△：先升高后降低；□：先降低后升高。大寫字母表示不同采樣點

注：誤差線表示95%的置信區間

3 討論

本研究中的茶園土壤硝化潛勢值為0.24~5.31?mg·kg-1·h-1，不同地區土壤間硝化潛勢存在明顯差異，其中江西上饒，AOA和AOB的含量均偏低，硝化潛勢也最小，而處于南亞熱帶地區的云南普洱，硝化潛勢最大。不同地區茶園土壤的硝化潛勢值在氣候帶間未呈現顯著差異。這很可能與長期的人為擾動，如施肥、耕作等栽培措施有關，削弱了氣候因素對土壤性質的影響。對不同自然生態區耕作土壤的研究發現，硝化微生物會對土壤環境擾動產生適應性[27]。

與耕地土壤相比，本研究中酸性茶園土壤硝化潛勢并未明顯低于北方的偏中性耕地土壤，且均高于湖南地區長期施肥的耕地紅壤（表4）。與自然生態系統相比，酸性茶園土壤硝化潛勢明顯高于酸性森林土壤[35,38]，與偏中性或堿性森林土壤相當[36-37,39]。茶園土壤硝化潛勢高于酸性森林土壤的原因可能與其周期性施肥有關，通常高肥力土壤具有較高的硝化潛勢[33]。

土壤硝化速率與pH密切相關[40]，因為酸性條件下，NH4+-N難以轉化為NH3，導致后續反應的底物供應不足；此外，低pH會抑制AOB活性[41-43]。而在本研究中，pH與土壤硝化潛勢的相關性并不顯著（表3）。這可能與培養體系環境有關，懸液培養有充足的外源性銨態氮補充，且pH調節到7.2，可能解除了酸化導致底物供應不足的問題。另一方面，可能與供試土壤氨氧化微生物群落組成有關，供試土壤的AOA豐度均明顯高于AOB（表1），且AOA對硝化潛勢的影響性更大（表3），表明在酸性茶園土壤中，AOA可能取代AOB成為驅動硝化過程的關鍵微生物，但與AOB相比，AOA更適應酸性條件[44]。對農田土壤研究發現，在我國南方酸性紅壤中，AOA和AOB的豐度均與硝化潛勢呈正相關，但AOA比AOB更加活躍[31,45-46]；而在北方潮土中，驅動氨氧化過程的主要是AOB，AOB豐度與硝化潛勢顯著正相關[28,47-48]。因此，盡管供試土壤均呈酸性，而主導酸性土壤氨氧化過程的AOA對低pH并不敏感，導致本研究中pH對酸性茶園土壤硝化潛勢的影響并不顯著。

表4 不同植被和土壤類型的硝化潛勢

此外，土壤有機碳、碳氮比、銨態氮、硝態氮、全氮也會影響土壤硝化潛勢（圖1），但是并未呈顯著相關性（表3），表明土壤性質對土壤硝化過程的影響可能更多是通過影響氨氧化微生物而間接起作用。研究發現，AOB對土壤有機碳變化較為敏感，有機碳增加會顯著提高AOB的群落多樣性，但對AOA影響不大[48]，因而土壤有機碳與硝化潛勢的相關性并不顯著（表3）。此外，因AOB對礦質氮的高親和力，因而更喜好高氮環境[49]，而AOA能可以直接利用有機碳，對碳氮比變化不夠敏感[50]，另外碳氮比的增加還會導致NH4+-N轉化為NH3的過程趨于緩慢，減少氨氧化過程的底物供應能力[51-52]。AOA、AOB作為氨氧化過程的直接參與者，對酸性茶園土壤硝化活性影響很大，因而土壤碳素、氮素有效性高低會通過影響氨氧化微生物間接對硝化活性造成影響。

在培養過程中，懸浮液中硝態氮含量隨培養時間具有3種變化趨勢，即隨培養時間增加、先增加后降低、先降低再升高（表2）。因硝態氮是硝化反應的主要產物，因此硝態氮含量隨反應進行而升高不難理解，而在部分樣品中出現硝態氮含量降低，這可能與無機氮的固持有關，當硝態氮發生生物或非生物固持后，其含量就會降低，再釋放出來后，含量又會升高[53]。土壤無機氮的固持可分為微生物同化和非生物固定兩種過程，其中，微生物同化硝態氮的速率與土壤中銨態氮的濃度和氮初級礦化速率呈正相關[54]，當銨態氮不能滿足微生物需求時，硝態氮的微生物同化就有可能發生。耕作土壤在培養1~4周后，硝態氮會發生顯著的微生物同化[55]。而大部分森林土壤會通過非生物過程迅速固定硝態氮[56-59]，不同土壤非生物固定硝態氮的能力變化很大[60-61]，熱帶森林土壤標記NO3--15N，在15?min后，NO3--N庫中15N的回收率已小于10%[62]。在本研究中，培養時間較短且有充足的外源性銨態氮補充，因此非生物固定可能是無機氮固持的主要過程。但因為本研究測定的硝態氮含量變化量，可近似認定為凈硝化速率，對無機氮固定在其中的貢獻，還需要采用同位素標記稀釋培養的方法加以確定。

4 結論

我國茶園土壤硝化潛勢值與耕作土壤相當，為0.24~5.31?mg·kg-1·h-1，高于其他農田土壤。不同地區茶園土壤硝化潛勢存在明顯空間差異，但地帶性規律并不明顯。茶園土壤硝化潛勢的空間差異主要受氨氧化微生物、碳素、氮素有效性控制，而AOA取代AOB成為驅動茶園土壤氨氧化過程的主要微生物。酸性茶園土壤硝化活性并不低，考慮到茶園氮肥用量大，因此采取合理施肥方式，減少氮素損失，提高氮肥利用率在茶園綠色栽培中更為重要。

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Characteristics of Soil Nitrification Potential in Different Tea Gardens of China

NIU Siyun, NI Kang, ZHAO Chenguang, MA Lifeng*, RUAN Jianyun

Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China

In order to characterize the nitrification activities of tea plantation soils in different areas, totally 30 typical soil samples from 12 provinces were collected. The soil nitrification potential was determined by using the shaken-soil-slurry method. The multiple regression analysis and partial least squares regression (PLS) were carried out to characterize the main impact factors. The nitrification potential in tea plantation soils ranged from 0.24 to 5.31?mg·kg-1·h-1, and the abundance of AOA in soil was significantly higher than that of AOB. Both AOA and AOB showed significantly positive correlation with soil nitrification potential. Abundance of ammonia oxidation microbes, C/N, nitrate, ammonium, total nitrogen and organic carbon contents were the significant important factors influencing nitrification potential, with a descending order of importance according to PLS. These results reveal that nitrification potential is still high in tea plantation soil, since AOA dominate the ammonia oxidation process. The difference of ammonia-oxidizing microorganisms, availability of soil carbon, nitrogen caused by climate, soil conditions and fertilization regimes are likely to be the main factors for the variation of the nitrification potential in tea plantation soils.

tea plantation soil, nitrification potential, ammonia-oxidizing microorganisms, soil properties

S571.1；S154.1

A

1000-369X(2019)06-731-11

2019-05-07

2019-09-07

國家自然科學基金（41601325）、中國農業科學院科技創新工程協同創新任務（CAAS-XTCX2016015）、中國農業科學院茶葉研究所基本科研業務費專項（1610212016012，1610212018018）

牛司耘，女，碩士研究生，主要從事茶園土壤養分方面的研究。

malf@tricaas.com