基于高通量測序篩選‘紫娟’花青素合成相關的miRNA

陳林波，夏麗飛，劉悅，孫云南，蔣會兵，田易萍，陳亮

基于高通量測序篩選‘紫娟’花青素合成相關的miRNA

陳林波1,2，夏麗飛1，劉悅1，孫云南1，蔣會兵1，田易萍1，陳亮2*

1. 云南省農業科學院茶葉研究所/云南省茶樹種質資源創新與配套栽培技術工程研究中心/云南省茶學重點實驗室，云南 勐海 666201；2. 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

為篩選調控紫娟茶樹花青素合成相關miRNA，以茶樹品種紫娟（ZJ）、云抗10號（YK）和福鼎大白茶（FD）為材料，構建了miRNA文庫。鑒定出46種已知的miRNAs和67種新的miRNAs，預測到具有注釋的靶基因765個。通過差異表達分析，篩選出在ZJ與YK、ZJ與FD共有差異表達的miRNA 24個。通過對24個差異表達miRNA的靶基因分析，篩選出可能參與調控花青素合成的miRNA 4個，包括miR828a、miR845c、novel_14和novel_87，其預測的靶基因包括轉錄因子基因、、、、以及4-香豆酰輔酶A鏈接酶（）、二氫黃酮醇4-還原酶（）和UDP-葡萄糖黃酮3--葡糖基轉移酶（）等基因。利用RT-PCR分析8個差異表達的miRNA，其結果與轉錄組分析一致。本研究結果為進一步開展茶樹花青素生物合成的調控機制研究奠定基礎。

茶樹；花青素合成；高通量測序；miRNA；靶基因

MicroRNA又稱miRNA，是廣泛存在于生物體內的一種長度約21~25個核苷酸組成的內源非編碼小分子RNA[1]。miRNA通過與靶mRNA互補配對來識別靶基因mRNA，在轉錄水平上降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯，從而調節靶mRNA的豐度和功能[2]。研究表明，miRNA對于植物花青素的生物合成具有一定的調控作用。在擬南芥中，miR156通過靶向SPL轉錄因子對花青素的生物合成起著負調控作用[3-4]；miR828通過介導調控靶基因，在缺磷條件下對、和的表達進行調控，進而影響花青素的積累[5]。過量表達miR778的擬南芥在缺磷條件下會促進花青素的積累[6]。在番茄中，miR858可通過靶向R2R3 MYB轉錄因子參與花青素合成的調控[7]。

目前關于茶樹花青素代謝的研究主要集中在關鍵酶和轉錄因子方面，例如MYB[8]、bHLH[9]、花青素合成酶[10-11]。然而，有關茶樹中miRNA介導的茶樹花青素生物合成的調節機制研究較少。紫娟是一種特異的茶樹品種，其幼嫩新梢芽、葉、莖均為紫色，富含花青素?；ㄇ嗨厥亲暇瓴铇淙~片呈現紫色的特征成分，是區別于其他茶樹的主要生化物質，也是決定紫娟茶健康功效的主要成分[12-13]。此外，紫娟茶還是提取天然花青素的重要來源物[14-15]。因此，我們利用Illumina HiSeq 2500測序平臺和生物信息學技術對紫葉茶樹和綠葉茶樹中的花青素代謝相關的miRNA以及靶基因進行比較分析，為進一步研究miRNA對茶樹花青素合成的調控機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別采摘云南省農業科學院茶葉研究所品種園內樹齡均為10年的紫葉茶樹品種紫娟（ZJ）、綠葉茶樹品種云抗10號（YK）和福鼎大白茶（FD）的一芽二葉，其中紫娟和云抗10號為阿薩姆茶（var.），福鼎大白茶為茶種（var.），液氮速凍后置于–80℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取與質量評估

RNA的提取采用美國Invitrogen公司的Trizol試劑盒，分別提取ZJ、YK、FD的總RNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，利用Nanodrop 2000微量分光光度計檢測RNA的純度，利用Qubit 4.0（美國）熒光定量儀對RNA濃度進行定量，利用Agilent 2100精確檢測RNA的完整性。

1.2.2 sRNA文庫的構建和測序

利用Small RNA Sample Pre Kit分別構建ZJ、YK、FD小RNA的cDNA文庫。采用Qubit 4.0熒光定量儀進行初步定量，使文庫濃度為1?ng·μL-1，再利用Agilent 2100對文庫的質量和Insert size進行檢測，測序與分析由北京諾禾致源生物有限公司完成。

1.2.3 sRNA測序數據分析

高通量測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別（Base calling）分析轉化為Raw reads。再將Raw reads帶接頭、低質量的reads進行處理，得到Clean reads。篩選長度范圍為18~30?nt的sRNA進行分析。用bowtie將長度為18~30?nt的sRNA定位到參考序列上，分析small RNA在參考序列上的分布情況。將mapped sRNA與miRBase中指定范圍序列進行比對，得到各樣品匹配上的sRNA詳細情況。選取Rfam中的rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA來注釋測序所得的小RNA。通過檢索miRBase21.0數據庫（http://www.mirbase.org）來確定已知的miRNA，采用miRNA前體的標志性發夾結構來預測新的miRNA[16-17]。

1.2.4 茶樹miRNA靶基因預測與功能分析

分析得到的已知miRNA和新的miRNA，利用psRobot軟件[18]對前期獲得的ZJ、YK和FD的轉錄組數據[19]進行靶基因預測，根據miRNA與其靶基因間的對應關系獲得miRNA靶基因。靶基因通過在線網站（http://www.geneontology.org）進行Gene ontology分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes數據庫（https://www.genome.jp）進行Pathway顯著性富集分析。

1.2.5 茶樹葉色相關miRNA篩選

對3個樣本中已知的和新的miRNA進行表達量的統計，采用TPM對miRNA表達水平的readcount數據進行標準化處理，再用DEGseq[20]進行差異分析。差異miRNA篩選條件為：qvalue<0.01 & |log2(foldchange)|>1。

1.2.6 實時熒光定量PCR的檢測

表1 實時定量PCR所使用引物

2 結果與分析

2.1 茶樹葉片總RNA的提取

采用Trizol試劑方法提取ZJ、YK和FD中的總RNA，經凝膠電泳（圖1）和紫外分光光度計檢測，其總RNA濃度分別為709、482、559?ng·μL-1，OD260/OD230值分別為2.05、2.00和1.90，OD260/OD280值分別為2.12、2.11、2.11，28?S和18?S條帶亮度等均符合轉錄組分析的要求。

2.2 茶樹葉片miRNA測序分析

利用高通量Illumina測序技術分別對ZJ、YK和FD的cDNA文庫進行測序，通過去除接頭、低質量reads、polyA/T/G/C以及N，分別獲得12?361?695（98.16%）、13?930?750（98.20%）、13?528?588（98.37%）條clean reads。篩選長度在18~30?nt范圍的sRNA分別有10?702?304（54.58%）、12?061?820（54.34%）、11?202?955（43.15%）條clean reads（表2）。

3個文庫中sRNA主要分布在21~24?nt范圍內，其中24?nt的最多（圖2），這些sRNA分布情況與其他報道的結果一致[22-23]。再利用bowtie將篩選后的sRNA定位到參考序列上，分析small RNA在參考序列上的分布情況。ZJ、YK和FD的clean reads中能mapped到參考序列的分別有5?774?584、6?835?843、6?278?768條。將mapped的sRNA通過NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和Rfam數據庫進行注釋。被注釋到的非編碼RNAs，包括已知miRNA、新miRNA、rRNAs、tRNAs、snRNAs、snoRNAs、TAS基因等（表3）。

注：M為DL5000 DNA Marker；1為紫娟；2為云抗10號；3為福鼎大白茶

表2 3個miRNA文庫測序數據

表3 被注釋到的各種miRNA數

注：ZJ：紫鵑，YK：云抗10號，FD：福鼎大白茶。下同

Note: ZJ: Zijuan. YK: Yunkang10. FD: Fuding dabaicha. The same as follow

2.3 茶樹已知miRNA的鑒定

為了鑒定茶樹已知miRNA，將3個文庫中mapped到參考序列上的reads利用miRBase 21.0數據庫中葡萄（）的miRNA數據進行比對，共鑒定出46條已知miRNA，分為26個家族，其中miR171、miR172和miR399分別有4個成員，miR167和miR319分別有3個成員，miR156、miR160、miR169、miR394、miR396和miR398分別有2個成員，其他均為1個成員。獲得已知的miRNA的長度為19~23?nt，其中大多數miRNA的長度為21?nt（表4）。

圖2 miRNA的長度分布

表4 已知的miRNA家族成員

續表4

2.4 茶樹新miRNA的預測

由于茶樹缺乏RNA背景，只能將獨特的小RNA序列映射到茶樹轉錄識別潛在的新miRNA序列。利用miRNA前體的標志性發夾結構預測新的miRNA[16-17]。通過BLASTn進行搜索和發夾結構預測，共發現了新的成熟miRNAs 67條。這些新miRNA序列長度為19~25?nt（表5），其中24?nt最多，占所有新預測miRNA的52.24%。這些沒有被歸類到已知miRNA家族的新miRNA，可能是茶樹miRNA新家族成員。

2.5 茶樹葉片miRNA靶基因預測

為了研究miRNAs對基因表達的調控作用，利用ZJ、YK和FD的轉錄組數據為參考[19]，采用psRobot軟件[18]對分析得到的已知miRNA和新miRNA進行靶基因預測。113個miRNA共預測到2?200個基因，其中765個基因具有注釋。這些被注釋到的基因包括、、、、、和等轉錄因子家族。結果發現，單個miRNA可同時調節多個靶基因，而單靶基因也可由多個miRNA調節，說明茶樹中miRNA具有多重靶向性。這些預測到的miRNA靶基因的準確性需要在未來的研究中進行驗證。

2.6 差異miRNA的篩選

通過高通量測序產生的序列可通過在文庫中的讀取數來計算miRNA的豐度。ZJ、YK和FD中已知和新miRNA的讀取數通過TPM進行標準化處理后，采用DEGseq進行差異分析[21]，差異miRNA篩選條件為|log2(foldchange)|>1和qvalue<0.01。篩選出在ZJ與YK、ZJ與FD之間共有的差異表達miRNA 24個（表6），在ZJ中上調表達的miRNA有13個，包括已知miRNA（miR845c、miR828a、miR482、miR399e、miR398a、miR398b、miR169a和miR162）和新miRNA（novel_93、novel_108、novel_36和novel_35）；在ZJ中下調表達的miRNA有9個，均為新miRNA（novel_87、novel_86、novel_84、novel_80、novel_46、novel_42、novel_37、novel_18和novel_14）。

2.7 差異miRNA靶基因分析

對獲得的24個差異miRNA的靶基因進行分析，發現具有注釋的靶基因227個，其中可能參與花青素合成調控相關的靶基因包括轉錄因子基因、、、和，參與花青素合成相關的結構基因包括4-香豆酰輔酶A鏈接酶5（）、UDP-葡萄糖黃酮3--葡糖基轉移酶3（）和UDP-葡萄糖黃酮3--葡糖基轉移酶6（）等（表7）。因此，推測在紫娟茶樹中差異表達的miR828a、miR845c、novel_14和novel_87可能參與花青素生物合成的調控，其成熟miRNA見圖3。這些預測到的參與花青素合成調控相關的miRNA需要在未來的研究中進行驗證。

表5 新的miRNA

表6 差異表達的miRNA

表7 miRNA部分靶基因

2.8 miRNA的qRT-PCR驗證

隨機選取8個miRNA，利用qRT-PCR檢測其在ZJ、YK、FD等茶樹葉片中的表達情況（圖4）。發現miR398a、miR398b、miR399e、miR828a在ZJ中的表達量高于YK和FD，novel_87、novel_84、novel_37和novel_14在ZJ中的表達量均低于YK和FD。8個差異表達miRNA在ZJ、YK和FD的相對表達量與測序分析的變化趨勢一致，說明高通量測序技術分析結果可靠。

3 討論

隨著對植物中miRNA研究的不斷深入，它已被證實廣泛作用于植物的生長發育[24-26]、次生代謝[27-29]、器官形態建成[30]等過程。近年來人們發現在轉錄后水平上miRNA對植物花青素合成具有不可替代的調控作用[3,5,31]。為了研究miRNA對茶樹花青素合成的調控機制，本研究構建了紫娟（ZJ）、云抗10號（YK）、福鼎大白茶（FD）的miRNA文庫并進行測序，分別獲得12?361?695、13?930?750、13?528?588條clean reads。miRNA讀數主要是21~24?nt，這與大多數被子植物中相應的讀數相似；以24?nt的數量最多，與煙草[32]、蘆筍[22]、杜仲[33]等作物一樣。

圖3 關鍵miRNA的前體莖環結構

圖4 miRNA表達的qRT-PCR分析

在本研究獲得的miRNA以及篩選在紫葉與綠葉茶樹差異表達的miRNA中，新預測的miRNA數量均遠高于已知miRNAs，表明本研究中新發現的miRNAs對紫娟茶樹葉片呈色和花青素合成貢獻較大。在擬南芥中miR828介導調控的靶基因與花青素合成有關，miR828能夠誘發轉錄本的剪切，進而調控下游靶基因、和轉錄因子以調控花青素的合成[31]。本研究預測到miR828的靶向基因為、、。在擬南芥中超表達miR828能阻礙轉錄因子[31]，推測參與了花青素的合成。本研究中還發現了新的novel_87靶向UDP-葡萄糖黃酮3--葡糖基轉移酶基因（）、4-香豆酰CoA連接酶基因（）和轉錄因子基因，novel_14靶向二氫黃酮醇4-還原酶基因（）。本課題組前期研究紫葉茶樹和綠葉茶樹葉片轉錄組差異，篩選花青素合成相關基因時，發現了4-香豆酰CoA連接酶（）、二氫黃酮醇4-還原酶（）、類黃酮糖基轉移酶（）在紫葉茶樹葉片中為上調表達[19]，這與本研究獲得的miRNA存在相反的表達模式。推測新預測的novel_87和novel_14可能參與了紫娟茶樹葉片呈色和花青素合成的調控。此外，預測到miR845c靶向和，MYB是重要的一類轉錄因子，可以直接或與bHLH和WD形成MYB-bHLH-WD復合物參與花青素合成[8-9]。在本研究中沒有發現miR858[5]，這可能是由于不同植物具有不同調控機制所導致。因此，本研究獲得的miRNA中一部分參與調控茶樹花青素的合成，但對于那些功能未知的miRNA與茶樹花青素合成的關系仍需進一步研究證實和確定。

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Screening of miRNA Related to Anthocyanin Synthesis in Tea Cultivar ‘Zijuan’ Based on High Throughput Sequencing

CHEN Linbo1,2, XIA Lifei1, LIU Yue1, SUN Yunnan1, JIANG Huibing1,TIAN Yiping1, CHEN Liang2*

1. Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Engineering Research Centerof Tea Germplasm Innovation and Matching Cultivation /Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science, Menghai 666201, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China

In order to screen the miRNAs related to anthocyanin synthesis in 'Zijuan', the miRNA library was constructed by using the tea cultivars 'Zijuan' (ZJ), 'Yunkang 10' (YK) and 'Fuding Dabaicha' (FD). In this study, 46 known miRNAs and 67 unknown miRNAs were identified, and 765 annotated target genes were predicted. A total of 24 miRNAs were screened out, which were differentially expressed between ZJ and YK, and between ZJ and FD. Four target miRNAs involved in the regulation of anthocyanin synthesis, namely miR828a, miR845c, novel_14 and novel_87, were identified by target gene analysis of 24 differentially expressed miRNAs. The predicted target genes include transcription factor genes,,,,and(4-coincyl-CoA-linked enzyme),(dihydroflavonol 4-reductase) and(UDP-glucoside flavonoid 3--glucosyltransferase). Eight differentially expressed miRNAs were analyzed by RT-PCR and the results were consistent with transcriptome analysis. Finally, a theoretical basis for further study of regulation mechanisms related to anthocyanin biosynthesis in tea plant was provided.

, anthocyanin synthesis, high throughput sequencing, microRNAs, target genes

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)06-681-11

2019-03-04

2019-05-25

國家自然科學基金項目（No.31560220）、國家重點研發項目（2016YFD0200903）、國家茶葉額產業體系（CARS-19）、云南省人才培養計劃項目（2015HB105）

陳林波，男，研究員，主要從事茶樹資源育種研究。

liangchen@mail.tricaas.com