致多部位感染肺炎克雷伯菌的毒力分析*

曹敬榮，王欣蕊,2，陳典典，王 巖，段園園，李文軍，謝 威，閔 嶸，王培昌△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)系，北京 100053)

肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，存在于人體上呼吸道和腸道，是引起醫(yī)院內(nèi)各類感染最常見病原菌之一，近年來感染率顯著升高[1-3]。尤其高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)侵襲力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高、致殘率和致死率高[2-6]，實(shí)驗(yàn)室診斷方面對其生物學(xué)特性還有待明確的地方。目前hvKP主要特點(diǎn)是對健康宿主造成嚴(yán)重感染的能力，導(dǎo)致不同尋常的感染部位，如眼內(nèi)炎和腦膜炎及神經(jīng)炎；感染易轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的能力，在瓊脂平板上生長的菌落外觀為高黏液表型[2-3,7-9]。因此，為了解宣武醫(yī)院致多部位感染肺炎克雷伯菌的毒力分布及同源性，本研究回顧性分析了宣武醫(yī)院2017年1月至2018年12月臨床分離的肺炎克雷伯菌的臨床資料、莢膜血清型、毒力基因及同源性，為減少醫(yī)院感染的流行提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 選擇首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院2017年1月至2018年12月臨床表現(xiàn)有敗血癥癥狀，血培養(yǎng)分離出肺炎克雷伯菌，同時其他1個或多個部位有感染表現(xiàn)、細(xì)菌培養(yǎng)為肺炎克雷伯菌，且不伴厭氧菌或其他細(xì)菌感染的患者及分離菌株作為研究對象，其中同一患者相同感染部位只選擇分離出的第一株菌。

1.2儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)由德國布魯克公司MALDI Biotyper 3.0提供；ABI Veriti 96孔梯度基因擴(kuò)增儀由美國ABI公司提供；DDY-6C型電泳儀由北京六一廠提供；高速離心機(jī)(eppendorf 5415D)、恒溫孵育箱由美國Thermo公司提供。哥倫比亞血平板、中國藍(lán)平板由Oxid公司提供；EXTaq酶、DL2000 DNA 分子量和6×加樣緩沖液，由日本Takara公司提供。甲酸、乙腈、α-氰-4羥基苯丙烯酸(HCCA)和三氟乙酸(TFA)由德國布魯克公司提供。

1.3方法

1.3.1菌種復(fù)蘇、傳代、鑒定 在菌種庫找到相應(yīng)菌株，轉(zhuǎn)種到血平板為“第一代”，挑取單個菌落傳到血平板 35 ℃ 16～18 h至第二代(純菌落)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和核酸提取。入選所有肺炎克雷伯菌嚴(yán)格按照第四版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》,接種血平板復(fù)蘇后，使用MALDI Biotyper3.0質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。

1.3.2黏液絲試驗(yàn) 使用接種環(huán)挑取血平板上的純菌落，如不能挑起黏液絲或黏液絲長度小于5 mm判為ST陰性，如挑起的黏液絲大于或等于5 mm判為陽性[2-3]。

1.3.3毒力血清分型、基因檢測 引物合成由上海生工公司合成，引物序列見表1。DNA模板提取：500 mL無菌水的EP管中取一菌環(huán)菌落混勻，100 ℃15 min，8 000 r/min，離心5 min，上清即為DNA。PCR擴(kuò)增莢膜血清型和毒力基因：反應(yīng)體系為25.0 μL，EX-Taq酶12.5 μL、蒸餾水5.0 μL、正向和反向引物各2.5 μL、待測樣本5.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃、預(yù)熱3 min，94 ℃變性40 s、43～60 ℃退火30～60 s、70 ℃延伸 60 s，共30循環(huán)后72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳120 V 30 min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果[2-3,9]。

表1 PCR擴(kuò)增毒力基因引物序列

1.3.4質(zhì)譜分析同源性 取分純的肺炎克雷伯菌菌株分別點(diǎn)樣在質(zhì)譜樣品靶板上，室溫干燥(5～10 min)后加70%甲酸1 μL，同時加1 μL的細(xì)菌測試標(biāo)準(zhǔn)品作為質(zhì)量控制，室溫條件下自然晾干后加1 μL HCCA基質(zhì)溶液均勻覆蓋，自然晾干備用。采用質(zhì)譜進(jìn)行樣品的數(shù)據(jù)采集和鑒定，質(zhì)譜儀線性正性模式頻率60 Hz，采集相對分子質(zhì)量為2 000～20 000的蛋白質(zhì)圖譜。每個樣品的蛋白譜在不同位置經(jīng)過240次的激光點(diǎn)擊獲得，采集的蛋白峰信息經(jīng)軟件校正與儀器內(nèi)數(shù)據(jù)庫圖譜比對，得到鑒定結(jié)果。通過flexAnalysis分析軟件獲取蛋白峰信息，用MALDI Biotyper3.0軟件進(jìn)行聚類分析及主成分分析[10-11]。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 臨床分布等資料采用Whonet5.6軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1肺炎克雷伯菌的臨床分布 通過Whonet5.6篩選出2017年1月至2018年12月同一患者同時侵入過血流及其他部位的肺炎克雷伯菌106株作為研究菌株，來自34位患者，均經(jīng)質(zhì)譜和PCR確定。肺炎克雷伯菌主要分離自重癥監(jiān)護(hù)室72%(77/106)、神經(jīng)內(nèi)科6%(6/106)、老年綜合科4%(4/106)、呼吸科4%(4/106)、產(chǎn)科4%(4/106)、骨科4%(4/106)和血液科4%(4/106)；標(biāo)本主要來源于血液34%(36/106)、痰液28%(30/106)、尿液16%(18/106)等；患者年齡分布28～91歲，平均年齡(66±5)歲，其中男性占70.7%，女性占29.3%。

2.2肺炎克雷伯菌的臨床特征 34位患者中臨床表現(xiàn)主要為血流感染(60%)、肺部感染(70%)、泌尿系感染(40%)、感染性休克(25%)及腹腔感染(8%)、膽道感染(5%)、盆腔感染(5%)和顱內(nèi)感染(5%)。34例患者住院期間的臨床處置包括進(jìn)行手術(shù)等侵入性操作者(85%)、保留引流管者(65%)、氣管切開或氣管插管者(58%)、留置導(dǎo)尿管(25%)、胃管(8%)。患者病情好轉(zhuǎn)占43%，院內(nèi)病死率占40%。

2.3黏液絲試驗(yàn)結(jié)果 黏液絲試驗(yàn)陽性24例(22%)，標(biāo)本主要來源于血液(30%)、痰液(30%)、尿液(17%)和引流液(8%)；黏液絲試驗(yàn)陰性者82例(78%)。

2.4血清型與毒力基因結(jié)果 共篩查了5個毒力莢膜血清型,包括K1 15%(17/106)、K2 42%(46/106)、K5 4%(4/106)、K54 11%(12/106)、K57 9%(9/106)，共檢出高毒力血清型88株，未分型18株。PCR擴(kuò)增共檢測到4種毒力基因，包括rmpA基因83%(88/106)、aero基因79%(84/106)、fimH基因80%(85/106)、mrkA基因94%(100/106)，WabG基因98%(104/106)，同時攜帶多種毒力因子者占47%。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，莢膜血清型與毒力基因檢測結(jié)果及分布見表2。

注：M為DNA 標(biāo)志物 DL2000；1～6為血清型，分別為K1(1 283 bp)、K2(641 bp)、K57(1 037 bp)、K54(881 bp)、K5(280 bp)和K3(549 bp)；7為陰性對照；8～12為毒力基因，分別為rmpA(536 bp)、fimH(688 bp)、Aero(556 bp)、mrkA(609 bp)和wabG(683 bp)

圖1PCR擴(kuò)增結(jié)果

表2 莢膜血清型與毒力基因檢測結(jié)果[n(%)]

2.5不同標(biāo)本中莢膜血清型和毒力因子的分布 血液和痰中均檢測到5個毒力莢膜血清型K1、K2、K5、K54和K57，尿液中未檢出K1和K5血清型，血液、尿液和痰中共檢出高毒力血清型82株。血液、尿液和痰中均檢測到5種毒力基因rmpA、aero、mrkA、fimH和WabG，結(jié)果見表3。

表3 主要標(biāo)本中莢膜血清型和毒力基因分布情況[n(%)]

2.6同源性分析結(jié)果 106株菌的質(zhì)譜同源性分為A型和B型2類，A型62株占59%，B型43株占41%，其中A1亞型42株占40%、A2亞型20株占19%，同一患者感染的菌株分型結(jié)果大部分一致，65%的患者為同一型別，由同一克隆的肺炎克雷伯菌引起多部位感染菌株間的同源性較小。

3 討 論

肺炎克雷伯菌為院內(nèi)感染的重要條件致病菌，會造成呼吸道、泌尿道、消化道、血流及皮膚軟組織等多部位感染[2-3]。本研究共收集宣武醫(yī)院2017-2018年兩年間發(fā)生多部位肺炎克雷伯菌感染患者34例，分離肺炎克雷伯菌菌株106株。肺炎克雷伯菌主要分布于ICU、普外科和神經(jīng)內(nèi)科(78%)，其他科室較少(22%)，標(biāo)本主要來源于血、痰和尿。年齡65歲以上者占75%，男性(70.7%)明顯多于女性(29.3%)。多部位感染患者的臨床資料分析血液和肺部同時感染的患者占比重較高，與其他研究結(jié)果一致[3]，特別是hvKP引起感染時，菌株可更早地從血液中分離，有引起轉(zhuǎn)移性感染的危險，提示臨床應(yīng)引起重視。hvKP多在無侵入操作史的情況下導(dǎo)致感染，并可更早地從血液中分離出來，最常引起同一患者血液和肝臟感染[3]；非hvKP多在侵入性操作導(dǎo)致機(jī)體黏膜屏障受損后引起血-膽和血-肺部感染，血液中細(xì)菌的分離多發(fā)生在侵入性操作后。回顧性分析臨床資料，發(fā)生院內(nèi)病死率為40%，主要發(fā)生在高齡、入住ICU、重癥胰腺炎等患者，與其免疫力低下、基礎(chǔ)疾病多、病情嚴(yán)重等相關(guān)。

黏液絲試驗(yàn)檢出高黏性肺炎克雷伯菌僅占22%，而黏液絲試驗(yàn)陰性占78%，提示致多部位感染患者分離的肺炎克雷伯菌以非高粘表型為主。莢膜血清型檢出了包括K1、K2、K5、K54和K57在內(nèi)的多種高毒力型別，其中以K2為主(42%)，不同標(biāo)本中均檢測到不同比率的莢膜血清型型別(表3)。分離的肺炎克雷伯菌攜帶rmpA、aero、mrkA、fimH和WabG等多種毒力基因[12-13]，同時檢測到3種及以上者占47%，血液、尿液和痰中均檢測出多種毒力因子。

同源性分析對流行病學(xué)調(diào)查具有十分重要的意義，目前常用的被廣泛認(rèn)同的基因分型方法有脈沖場凝膠電泳、多位點(diǎn)序列分型、腸道細(xì)菌間重復(fù)序列PCR分型和隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性等分子生物學(xué)手段，但受限于其耗時長、成本高、操作繁瑣等，難以實(shí)現(xiàn)快速同源性分析。MALDI-TOF MS是近年來飛速發(fā)展起來的一種新型微生物鑒定技術(shù)，通過分析不同種屬微生物保守且獨(dú)特的蛋白峰進(jìn)行種內(nèi)分型[10-11,14]，可在幾分鐘內(nèi)完成對可疑細(xì)菌鑒定的同時進(jìn)行同源性分析，本實(shí)驗(yàn)研究的106株菌的同源性分析顯示，分為兩大群，同時A群又分為兩亞群，包括A1(40%)、A2(19%)和B(41%)型，以A型為主要流行株。65%的同一患者感染的菌株分型結(jié)果一致，但由同一克隆的肺炎克雷伯菌引起多部位感染菌株間的同源性較小，聚類分析與耐藥菌株同源性相比較分散[13]。利用質(zhì)譜技術(shù)能及時對病原監(jiān)測、感染源監(jiān)測、傳播途徑調(diào)查等，符合院內(nèi)感控工作對病原菌流行病學(xué)分型快速有效的要求，可為醫(yī)院感控工作及時提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。但質(zhì)譜同源性分析依據(jù)蛋白質(zhì)譜圖分類，與傳統(tǒng)分型方法多基于核酸分析存在明顯差異，相關(guān)研究相對較少，需分析多重影響因素綜合分析[11]。本研究發(fā)現(xiàn)雖然同一患者多個部位都分離出同種的肺炎克雷伯菌，但菌株并不一定同源，這就為臨床和微生物工作者對感染的分析提供了證據(jù)：應(yīng)考慮同一患者感染同種不同型菌株的可能。因此在微生物工作中不應(yīng)因鑒定為同一種細(xì)菌而省略了藥敏試驗(yàn)，在臨床治療上也應(yīng)全面考慮抗菌藥物選擇的問題。

4 結(jié) 論

本院分離出的致多部位感染肺炎克雷伯菌主要分布在ICU病房，K2血清型是本院最常見的莢膜血清型，同時檢測到多種毒力基因。雖然同一患者血液和其他部位均可分離出肺炎克雷伯菌，但細(xì)菌的分子型別存在差異，需結(jié)合細(xì)菌的同源性分析和其他指標(biāo)綜合判斷。hvKP多在無侵入操作史的情況下導(dǎo)致感染，并可更早地從血液中分離出來，值得臨床注意。