兒童血清降鈣素原參考區間的調查

吳 薇，曹子文，文江平△

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院檢驗科，北京 100730;2.首都醫科大學臨床檢驗診斷學系，北京 100069)

降鈣素原(PCT)在正常生理情況下由甲狀腺旁C細胞產生，是無激素活性的降鈣素前肽物質，可經特異性肽鏈內切酶裂解生成降鈣素[1-2]。在健康成年個體中PCT水平非常低(<0.1 ng/mL)，但在細菌感染時循環系統中的PCT水平會快速升高[3]，已被廣泛應用于細菌感染性膿毒癥的診療[4-6]。PCT檢測方法中化學發光法靈敏度高，最低可檢出0.02 μg/L的PCT[7]，是檢測PCT的最佳方法[8]。臨床上普遍認為成年人PCT的參考區間為PCT<0.05 ng/mL。但參考區間存在變異，所以實驗室有必要為不同年齡、性別的人群建立PCT的參考區間。兒童與成年人相比，更易發生感染性疾病。報道顯示出兒童PCT參考區間可能會高于成年人[9-11]。

本研究參考國際標準化委員會(ISO)15189相關準則，按照實驗室醫學聯盟(IFCC)規定的參考個體標準[12]，采用回顧性采樣法[13]，初步探討用微粒子酶促化學發光法測定PCT，調查適用于兒童(≤14歲)及本實驗室檢測系統的PCT生物參考區間，旨在合理利用PCT檢測結果診斷兒童是否發生細菌感染，指導抗菌藥物使用，為相關疾病診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年11月至2019年2月在首都醫科大學附屬北京同仁醫院進行術前檢查的兒童，年齡為出生后3 d至14歲。就診原因僅限于眼科疾病如高度近視、白內障、青光眼、視網膜脫落、角膜移植、斜視、屈光不正，及耳鼻喉科疾病如腺樣體肥大、唇裂、先天性耳前瘺、先天性耳聾。入選標準：營養良好，無發熱、貧血、黃疸及藥物使用或慢性病史。年齡為出生后3 d至14歲。血壓、B超、胸片正常，肝功常規、腎功常規、血脂常規、離子常規、血常規，C反應蛋白(CRP)和尿常規檢查均正常。具體指標的數值需符合兒童專用的參考區間[14]。排除標準：參考個體排除標準：根據《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》中所規定的要求，排除存在貧血、上呼吸道感染、發熱、甲狀腺疾病、腫瘤、肝腎疾病、過敏反應、結締組織病、免疫缺陷病和風濕性疾病等內科疾病的患者。排除嚴重失血、嚴重外傷或休克、傷口感染、應激性反應等外科疾病的患者。排除個體肥胖、近期服用藥物、有過外科手術、食素、有家族遺傳病史的患者。排除年齡為0～3 d的兒童、存在急慢性炎癥及近3個月來最近一次實驗室檢查結果在上述檢查項目正常參考區間外的患者。標本剔除標準為：微生物污染的樣本；高度溶血、黃疸或乳糜樣本，水平以性能驗證為準，廠家參考區間為血紅蛋白<7.6 mmol/L，膽紅素<541 μmol/L，三酰甘油<18.29 mmol/L；凍融1次的全血標本或反復凍融2次以上的血清樣本。經以上入選標準和排除標準剔除不合格者，最終入選400例出生3 d至14歲的就診患者，其中男217例、女183例。再嚴格按照上述標準在2019年3-4月就診患者中另選取80例用于參考區間的驗證，其中男40例、女40例，年齡均為出生后3 d至14歲。

1.2儀器與試劑 采用美國BECKMAN-COULTER 公司的UniCel DxI800免疫分析系統(儀器序列號為602423；儀器系統號為1965899)，應用四川省沃文特生物技術有限公司的降鈣素原質控品及配套試劑盒(微粒子酶促化學發光法，試劑批號為435699、配套定標液批號為900101、效期：20200101)。按ISO 17511規定量值溯源至德國BRAHMS公司建立的第2代參考物質PCT115。凍存血清統一復融，高速離心后取上層清液進行檢測，操作嚴格按照儀器和試劑說明書進行。

1.3收集方法 按說明書要求采集所有入選對象空腹靜脈血3 mL，1 400×g離心10 min分離血清，待完成其他生化檢測后分離收集剩余血清至1.5 mL尖底離心管中，按上述標本剔除標準排除溶血、乳糜、黃疸等樣本，將收集到的樣本編號后放在試管架上保存于-80 ℃冰箱待測，過程中避免反復凍融，所有冷凍樣本僅在檢測前于室溫中復融1次。

1.4質量保證 嚴格執行室內質控程序，按照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)的EP9-A2文件，采用四川沃文特生物技術有限公司的PCT質控品(水平1批號為900101、水平2批號為900102、水平3批號為900103)進行質控。在進行檢測前，對儀器進行重新定標，檢測3個水平的質控品，確保在控。使用的儀器按照中國合格評定國家認可委員會的要求校準，性能驗證合格。在同一天8 h內完成全部樣本檢測，避免天間變異。

1.5檢測原理 采用微粒子酶促化學發光法，即用已包被特異性抗體的無磁性微粒子作為固相載體與血清中的PCT發生免疫學反應，以堿性磷酸酶作為發光劑。

1.6參考區間驗證 檢測80例患者血清PCT水平，將檢測結果剔除離群值后，保證每組至少有20例樣本，計算R值。R=測定結果在參考區間內的例數/總測定例數。如80例參考個體中不超過8例檢查結果落在所驗證的參考區間外(即R≥90%)，則可基本認為該參考區間適用；如果有9例及以上的觀測值落在參考區間外，則證明該參考區間不適用。

2 結 果

2.1參考個體的一般實驗室檢測項目分析 400例參考個體分別測定了肝功常規、腎功常規、血脂常規、離子常規、尿常規、血常規和C反應蛋白等項目。其中白細胞計數(WBC)與C反應蛋白(CRP)檢測結果見表1。PCT檢測結果與相對應的WBC和CRP結果分別進行Spearman相關性分析，差異均無統計學意義(r<0.3，P>0.05)。說明在本研究參考人群中PCT水平越高，WBC與CRP結果也會相應升高，但是二者的升降趨勢與PCT水平無必然聯系。同時在檢測結果中發現出生后3 d至2歲患兒WBC較2～14歲患兒高，而紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(Hb)與后者相比較低。符合人民衛生出版社第5版《臨床檢驗基礎》所描述的兒童血常規變化趨勢，即0～2歲兒童WBC升高明顯，2歲后WBC逐漸平穩下降但始終稍高于成人。

表1 不同人群PCT、CRP與WBC檢測結果比較

2.2檢測系統性能評價 按照EP9-A2文件要求進行檢測系統性能評價，結果顯示，檢測系統的批內精密度、批間精密度、重復性、回收率、線性范圍、靈敏度、攜帶污染率等性能指標均符合臨床使用要求。

2.3離群值判斷 將所有檢測對象的PCT檢測結果按年齡升序排列后，疑似最大離群值為0.96 ng/mL，以其計算D/R值為0.185，小于1/3，故保留所有檢測數據。

2.4參考個體PCT水平的比較 按照年齡對納入的參考個體進行分組，經非參數秩和檢驗分析，發現不同組間檢測結果比較差異無統計學意義(P>0.05)。不同年齡段參考個體PCT檢測結果以M(Q1，Q3)表示，3 d至1歲、1～<2歲、2～<4歲，4～<6歲、6～<8歲、8～<10歲、10～<12歲、12～≤14歲患者均為50例，其PCT水平分別為[0.140(0.100,0.230)ng/mL]、[0.190(0.150,0.375)ng/mL]、[0.175(0.140,0.288)ng/mL]、[0.170(0.133,0.310)ng/mL]、[0.135(0.103,0.238)ng/mL]、[0.145(0.110,0.260)ng/mL]、[0.130(0.100,0.238)ng/mL]、[0.130(0.070,0.210)ng/mL。同樣217例男性與183例女性兒童PCT檢測結果分別為[0.160(0.110,0.280)ng/mL]和[0.160(0.110,0.280)ng/mL]，差異無統計學意義(P=0.283)。

2.5正態性檢驗 以所有檢測結果繪制頻數分布圖，使用Kolmogorov-Smirnov法進行正態性檢驗，數據呈非正態分布，見圖1。

圖1 出生后3 d至14歲人群PCT檢測數據頻數分布圖

2.6建立生物參考區間 結合400例納入對象PCT檢測結果頻數分布及PCT臨床意義，以95%分位數為上限確定生物參考區間，即以第380位數據為參考上限，建立本檢測系統的兒童PCT生物參考區間為PCT≤0.46 ng/mL。

2.7驗證生物參考區間 另選取的80例患者PCT檢測結果均通過驗證，即檢測結果落在本研究參考區間外的個數為0例(R值≥90%)，說明本研究建立的參考區間是適用且可被轉移的。

2.8與其他文獻報道結果比較 目前國內涉及兒童PCT參考區間建立范圍僅有重慶醫科大學附屬兒童醫院檢驗科研究報道的結果為PCT≤0.038 ng/mL，即健康兒童PCT水平≤0.038 ng/mL，較本實驗結論相比有較大的出入，其結果的統計分析同樣顯示PCT檢測結果在不同年齡和性別間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。在國外研究中，也有少量間接涉及未成年人PCT的相關研究，與本研究結果較為符合，見表2。

表2 其他文獻報道的PCT參考區間

3 討 論

本研究嚴格遵守《醫學實驗室質量和能力認可準則》中的要求，按照CLSI EP28-A3c文件，利用400例參考個體樣本的PCT測定結果和統計結果，調查了適用于出生后3 d至14歲人群的PCT生物參考區間，即PCT≤0.460 ng/mL，本結果明顯高于健康成年人的參考區間。

國內大部分實驗室通常認為成年人PCT質量濃度的正常值應為<0.050 ng/mL，與上述重慶醫科大學附屬兒童醫院的研究結果顯示的兒童生物參考區間(≤0.038 ng/mL)沒有本質上的區別。也有外國學者認為成年人PCT水平≥0.25 ng/mL時即可確認為細菌感染，建議使用抗菌藥物[22]。這些區間上限明顯低于本實驗所給出的結論，但是在不考慮儀器試劑等差異的情況下，參考區間也會受到生物所固有變異性、生活地區、生活水平影響而發生改變，不可能是一個固定的范圍。因此，與實驗預期相符，本研究與其他研究所報道的參考區間有一定符合也有一定差異，符合國外文獻的報道，但與重慶醫科大學附屬兒童醫院建立的參考區間相比較寬，可能與不同地區兒童飲食習慣差異有關，所以建議各實驗室依據不同臨床需求把前來本院就診的兒童當做特殊人群，去建立符合其生理情況的準確參考區間。同樣，本研究納入標準中采用的各年齡段血常規參考區間，也只能覆蓋95%人群，入選的參考個體WBC結果即便在參考區間內，也不能確保不存在感染，所以本研究在分析參考人群血清PCT檢測結果的同時，對其WBC與CRP結果進行了相關性分析，分析結果顯示三者之間無聯系，說明納入的人群不存在會使PCT水平上升的細菌感染，確保了結果的準確。經大量研究確認的是，新生兒的降鈣素原水平在出生后短期內會生理性增高[23]，最高值可達21 ng/mL，平均值為2 ng/mL，所以國內相關研究所納入的對象年齡最小也有7個月。但是相關文獻同樣表明，新生兒出生后3 d PCT水平便會下降并維持相對固定的水平，所以本研究填補了出生后3 d至半年兒童降鈣素原參考區間未有人涉及的空缺。其他研究的樣本量較小，年齡分組過于寬泛，未滿足《兒科學》第6版中推薦的7個年齡段，并且在建立好參考區間后也未進行參考區間的驗證，本研究針對以上方面均做出了相應改進。

本研究也存在一定局限性：(1)兒童參考個體雖不易受吸煙、酗酒等不良嗜好的感染，但是本研究未針對兒童飲食習慣設定納入或排除標準，對于兒童的營養狀態也僅通過身高、體質量及一部分實驗室檢查項目間接評估。(2)本研究采用的是回顧性采樣法，用于檢測PCT的血清是做完其他生化項目的剩余血清，有些樣本可能會在室溫或4～8 ℃冰箱中儲存一段時間，根據研究表明，在4 ℃保存12 h的血清PCT質量濃度會下降6%[24]。(3)由于化學發光試劑昂貴，本研究經費有限，所以樣本量僅有400例，無法再擴大樣本進行驗證，且男女比例也未能達到1∶1；無法再細化分組，不能調查PCT在胎兒期、新生兒期及嬰兒期是否存在差異。(4)今后應在制定并遵守適用于出生3 d內新生兒的納入標準的前提下，進一步探究新生兒PCT的生物參考區間。(5)建立參考區間最重要的質量保證就是檢測方法的溯源性，但PCT目前并不能按ISO 17511溯源至國際單位制(SI)，德國BEAHMS公司建立的PCT溯源鏈，其設定未考慮到年齡、性別、地域的差異，建立適當的參考區間尚需要大量數據積累和相應分析，只有排除潛在的干擾因素才能使生物參考區間具有廣泛的適應性，覆蓋不同人群，滿足臨床需要。

針對以上不足，希望在未來有條件的時候，采用多中心、盲法的實驗設計；擴大有效樣本量；對不同地域進行分組；用諾爾曼PCT檢測系統對出生3 d內嬰兒末梢血檢測，從而建立起與兒童人群免疫系統正常發育規律相符合的生物參考區間。

4 結 論

本研究成功地在更大范圍上更精準地建立了出生后3 d至14歲兒童PCT生物參考區間。發現了兒童PCT水平與成人有較大差別，評估兒童感染狀況時不能以成人參考區間作為依據。有助于兒童感染性疾病的診斷、輔助用藥及預后觀察，為完善地建立兒童實驗室檢查項目的參考區間進一步奠定了基礎。