不同方法對(duì)細(xì)菌性陰道病檢出效果的研究

董一紅，李 偉，楊 忱，車冬麗，王 芳，張 曦，王 雪，高 萱,王迎辰,譚延國(guó)△

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.婦產(chǎn)科，北京 100038；3.首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)系，北京 100069)

陰道炎為婦科高發(fā)疾病，具有流行范圍廣、發(fā)病率高、病原菌種類多的特點(diǎn)[1]。其中細(xì)菌性陰道病(BV)是育齡婦女最常見的陰道感染性疾病之一，該病以明顯的陰道微生態(tài)環(huán)境紊亂導(dǎo)致多種致病細(xì)菌感染為主要特征，育齡期婦女發(fā)病率為4.96%～36.00%[2]，婦科門診患者發(fā)病率可高達(dá)50.40%[3]。BV婦女患盆腔炎、淋病和感染HIV的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，而且BV孕婦易出現(xiàn)反復(fù)流產(chǎn)、早產(chǎn)或產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎等不良妊娠結(jié)局[4-5]。因此，對(duì)BV及時(shí)診斷，有利于早期治療、提高治療效果，防止病情進(jìn)一步惡化。

BV主要臨床表現(xiàn)為陰道分泌物異常并伴有異味，但大多數(shù)BV患者無臨床表現(xiàn)，故BV的診斷僅僅依靠患者的臨床癥狀和體征是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還要依賴于陰道分泌物的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。目前陰道分泌物檢測(cè)方法較多，如濕片鏡檢法、干化學(xué)酶法(唾液酸苷酶法)、乳膠免疫層析法、核酸雜交法、革蘭染色Nugent評(píng)分法，Amsel法等，每種方法有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。其中Nugent評(píng)分法為實(shí)驗(yàn)室金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法操作相對(duì)復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)室有必要尋找1種或幾種靈敏度高、特異度強(qiáng)、易于操作的方法。本研究使用濕片鏡檢法、干化學(xué)酶法(唾液酸苷酶法)、乳膠免疫層析法、核酸雜交法及革蘭染色Nugent評(píng)分法5種方法同時(shí)測(cè)定211例陰道分泌物標(biāo)本，以革蘭染色Nugent評(píng)分法為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估每種方法對(duì)BV的檢出效果。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1-5月期間于本院婦科門診就診的患者中有陰道瘙癢等癥狀或陰道分泌物有不同程度異常、異味的患者共211例，年齡18～75歲，平均(37.64±10.74)歲。妊娠期、月經(jīng)期、陰道近期有用藥史及48 h內(nèi)有性生活史的患者被排除本研究外。

1.2標(biāo)本采集 婦科醫(yī)生在無菌的條件下借助窺器，分別使用本實(shí)驗(yàn)所用不同商品試劑盒所提供的專用無菌拭子，于患者陰道后穹隆處采集陰道分泌物樣本，并將采樣拭子分別放到各自的樣本采集管中待檢測(cè)。

1.3方法

1.3.1濕片鏡檢法 將樣本加入滴有少量生理鹽水的載玻片上，涂抹均勻，制備成濕片，蓋上蓋玻片，至于顯微鏡下觀察。鏡下線索細(xì)胞大于上皮細(xì)胞的20%，提示BV。

1.3.2乳膠免疫層析法 由北京泰格科信生物科技有限公司提供的陰道炎抗原三聯(lián)檢試劑盒為基于乳膠免疫層析法的抗原聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，同時(shí)分別測(cè)定白色念珠菌、陰道毛滴蟲和陰道加德納菌抗原。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。結(jié)果判定：陽性為當(dāng)陰道加德納孔檢測(cè)線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，表明樣本中含陰道加德納菌抗原；陰性為僅質(zhì)控線出現(xiàn)條帶，為樣本中不含有陰道加德納菌或含量低于可檢測(cè)范圍。

1.3.3干化學(xué)酶法/唾液酸苷酶法 由鄭州安圖綠科生物工程有限公司提供的陰道炎干化學(xué)五聯(lián)檢試劑盒是基于干化學(xué)酶法的聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，可同時(shí)檢測(cè)白細(xì)胞酯酶、唾液酸苷酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶等6項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。如唾液酸苷酶顯紅色、紫紅色(陽性，第3孔)，提示為BV。

1.3.4核酸雜交法 Affirm VPⅢ核酸雜交法試劑盒(美國(guó)BD公司)，可同時(shí)檢測(cè)念珠菌、陰道毛滴蟲和陰道加德納菌3項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。陽性為目標(biāo)微生物微球顯藍(lán)色，表明樣本中存在陰道加德納菌，提示BV。

1.3.5革蘭染色Nugent評(píng)分法 實(shí)驗(yàn)室具備條件者，可采用Nugent評(píng)分法診斷BV，更為客觀準(zhǔn)確[6]。標(biāo)本直接涂片自然晾干，迅速通過火焰2～3次固定，常規(guī)革蘭染色后油鏡鏡檢。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1，正常：0～3分；BV中間型：4～6分；BV：7～10分。上述所有操作嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版執(zhí)行[7]。

表1 革蘭染色Nugent評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(分)

注：按每10個(gè)油鏡視野所觀察到的每種細(xì)菌的平均數(shù)量進(jìn)行計(jì)算和分值分配;總分值是4種細(xì)菌分值的總和

1.3.6質(zhì)量控制 干化學(xué)酶法、乳膠免疫層析法、核酸雜交法在實(shí)驗(yàn)前分別作商品化的質(zhì)控品，質(zhì)控通過后，做實(shí)驗(yàn)樣本。濕片鏡檢法，革蘭染色Nugent評(píng)分法由有形態(tài)學(xué)資質(zhì)、經(jīng)驗(yàn)豐富的人員評(píng)判。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，4種方法與金標(biāo)準(zhǔn)的差異性采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)(McNemar檢驗(yàn))。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4種方法與金標(biāo)準(zhǔn)方法的一致性比較采用kappa檢驗(yàn),判斷標(biāo)準(zhǔn)：Kappa≥0.75為一致性較好，0.75>Kappa≥0.4為一致性一般，Kappa<0.4一致性差。各種方法診斷效能分別使用受試者工作特征曲線(ROC曲線)進(jìn)行評(píng)估，曲線下面積(AUC)在0.90以上表示診斷價(jià)值較高、0.70～0.90表示診斷價(jià)值中等、0.50～0.70表示診斷價(jià)值較低。

2 結(jié) 果

2.1BV流行情況 211例患者中，如以革蘭染色Nugent評(píng)分法為金標(biāo)準(zhǔn)，則BV在婦科門診患者中的檢出率為17.06%(36/211)；如以5種方法中任意一種方法檢出BV為準(zhǔn)，則BV的檢出率為20.30%(43/211)，與文獻(xiàn)[2]中報(bào)道一致。

2.24種方法的檢測(cè)效果及檢測(cè)一致性分析 使用配對(duì)卡方檢驗(yàn)(McNemar檢驗(yàn))，濕片鏡檢法與干化學(xué)酶法的χ2值分別為125.484、131.640，P值均為0，這兩種方法檢出BV的能力與革蘭染色Nugent評(píng)分法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；乳膠免疫層析法、核酸雜交法(BD探針)的χ2值分別為28.079、119.211，P值分別為0.349、1.000，這兩種方法檢出BV的能力與革蘭染色Nugent評(píng)分法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)Kappa一致性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干化學(xué)酶法和核酸雜交法與革蘭染色Nugent評(píng)分法具有較高的一致性(Kappa分別為0.768、0.752)；濕片鏡檢法與革蘭染色Nugent評(píng)分法的一致性稍差(Kappa=0.746)；乳膠免疫層析法與革蘭染色Nugent評(píng)分法的一致性最差(Kappa=0.363)，見表2。

表2 濕片鏡檢法、干化學(xué)酶法、乳膠免疫層析法、核酸雜交法與Nugent評(píng)分法檢出效果比較(n)

2.34種方法診斷BV的性能評(píng)估 反映各種方法檢測(cè)BV性能的各項(xiàng)參數(shù)見表3。結(jié)果顯示，濕片鏡檢法和干化學(xué)酶法具有良好的特異度及陽性預(yù)測(cè)能力，假陽性率最低，并具有較好的診斷符合率；核酸雜交法的靈敏度最高，診斷符合率好，診斷效能最優(yōu)；乳膠免疫層析法對(duì)于BV診斷的效能較低。采用ROC曲線評(píng)估4種檢測(cè)方法對(duì)BV的診斷效能。應(yīng)用4種檢測(cè)方法的靈敏度與特異度做ROC曲線，并計(jì)算AUC，見圖1。相比較核酸雜交法AUC值最大，濕片鏡檢法AUC值和干化學(xué)酶法AUC值次之，乳膠免疫層析法AUC值最小。

表3 4種方法診斷BV的性能結(jié)果

2.45種方法的總符合率 本研究211例入選標(biāo)本中，所有檢測(cè)方法都呈陽性的共5例(2.40%)，都呈陰性的共132例(62.60%)，總體符合率為64.90%(137/211)。

2.5革蘭染色Nugent評(píng)分處于BV中間型分析 共有17例樣本處于革蘭染色Nugent評(píng)分中間型(4～6分)，進(jìn)一步分析這17例樣本其他方法檢測(cè)結(jié)果,見表4。由于核酸雜交法與革蘭染色Nugent評(píng)分對(duì)于BV的檢出效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)且診斷效能最高(AUC=0.880)，故以核酸雜交法為診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中有2例為BV。

圖1 4種方法診斷BV的ROC曲線圖

表4 Nugent評(píng)分中間型樣本其他方法檢測(cè)結(jié)果分析(n)

2.6聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果 選取簡(jiǎn)便易行的濕片鏡檢法與其他3種方法分別聯(lián)合檢測(cè)，濕片鏡檢+干化學(xué)酶法檢出BV的靈敏度為75.00%，特異度為100.00%；濕片鏡檢+乳膠凝集法檢出BV的靈敏度為80.56%，特異度為86.86%；濕片鏡檢+核酸雜交法檢出BV的靈敏度為91.70%，特異度為94.90%，結(jié)果見表5。

表5 濕片鏡檢法與其他3種方法聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果(n)

3 討 論

BV是臨床表現(xiàn)多為陰道分泌物增多，白帶氣味異常，外陰有灼熱瘙癢感等育齡婦女最常見的陰道感染性疾病，如果不能及時(shí)診斷及治療，可以使病情進(jìn)一步惡化，嚴(yán)重的可能出現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、慢性盆腔炎、宮頸上皮異常增生等疾病，進(jìn)而對(duì)患者生殖系統(tǒng)造成損害，誘發(fā)不孕。故靈敏、快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，有助于BV的及早診斷及合理治療。目前我國(guó)有多種基于不同原理的方法用于對(duì)BV診斷和鑒別診斷[8]。其中革蘭染色Nugent評(píng)分法是根據(jù)細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行半定量測(cè)定的方法，被視為實(shí)驗(yàn)室診斷BV的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。該方法是將分泌物涂片進(jìn)行革蘭染色，然后在油鏡下選定4種優(yōu)勢(shì)菌(乳酸桿菌、GV、普雷沃菌、動(dòng)彎桿菌)形態(tài)并用半定量評(píng)估法對(duì)其進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)每個(gè)視野細(xì)菌數(shù)量的多少換算成積分(0～10分)，標(biāo)本總分值是4種細(xì)菌形態(tài)分值之和，BV的診斷標(biāo)準(zhǔn)為≥7分，4～6分為臨界范圍，0～3分為正常[10]。本研究以革蘭染色Nugent評(píng)分法為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)上述4種方法用于檢測(cè)BV的檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)估。

本院婦科就診的人群中，BV的流行率為17.06%，這與其他研究報(bào)道的較為一致[2]。這些方法中以濕片鏡檢法、干化學(xué)酶法特異度最高，核酸雜交法靈敏度最好。干化學(xué)酶法和核酸雜交法與革蘭染色Nugent評(píng)分法具有較高的一致性(Kappa值分別為0.768、0.752)；核酸雜交法AUC值最大(0.880)，對(duì)BV的診斷效能最好。干化學(xué)酶法主要檢測(cè)的是唾液酸苷酶，它是由陰道加德納菌及其他厭氧菌產(chǎn)生的一種特異性代謝產(chǎn)物，其活性與致病菌的數(shù)量存在線性關(guān)系[11]，故通過檢測(cè)唾液酸酶的活性來診斷BV具有較高的特異度和符合性；核酸雜交法使用針對(duì)陰道加德納菌獨(dú)特基因序列互補(bǔ)的兩種核酸單鏈探針(捕獲探針和顯色探針)，靈敏度高、特異度好，故與革蘭染色Nugent評(píng)分法具有較高的一致性及良好的診斷效能。乳膠免疫層析法的靈敏度、特異度及一致性較差，分析其原因，該方法為針對(duì)陰道加德納菌抗原的雙抗體夾心法，可能存在如下原因：(1)試劑單克隆抗體純度問題；(2)由于感染菌量過大造成前帶效應(yīng)；(3)由其他厭氧菌感染所致的BV漏檢，從而導(dǎo)致乳膠免疫層析法的靈敏度和特異度較差，對(duì)BV的診斷效能不理想。

本研究中共有17例樣本處于革蘭染色Nugent評(píng)分中間型(4～6分)，由于核酸雜交法與革蘭染色Nugent評(píng)分對(duì)于BV的檢出效果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)，故以核酸雜交法為診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中有2例為BV，由此可見在實(shí)驗(yàn)室診斷選取的“金標(biāo)準(zhǔn)”也可能存在漏檢的情況。由于濕片鏡檢法成本低、易于操作，且具有較好的特異度，適合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展，顧本研究選取該方法與其他3種方法分別聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)BV的檢出的靈敏度均有提高。其他文獻(xiàn)中還運(yùn)用到了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法，PCR的檢測(cè)方法是一種新型檢驗(yàn)技術(shù)，根據(jù)PCR的靈敏度和DNA雜交的特異度進(jìn)行檢驗(yàn)[12]，本研究受實(shí)驗(yàn)室技術(shù)條件所限，未將該方法納入研究范圍。

4 結(jié) 論

革蘭染色Nugent評(píng)分法雖然準(zhǔn)確性高，但操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)，不適于作為常規(guī)檢測(cè)方法；濕片鏡檢法成本低、易于操作，可作為實(shí)驗(yàn)室診斷BV的初篩；干化學(xué)酶法的特異度較好，操作簡(jiǎn)單，有條件的實(shí)驗(yàn)室可作為參考；乳膠免疫層析法雖然為近年來出現(xiàn)的新方法，但方法學(xué)仍不成熟，檢測(cè)效果亟待提高；核酸雜交法對(duì)于BV的檢出效能最好，但仍存在操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)費(fèi)用高等缺點(diǎn)。濕片鏡檢法與其他3種方法分別聯(lián)合檢測(cè)，可提高BV的檢出率。