長鏈非編碼RNA CTD-3162L10.1調節SEMA3B表達對卵巢癌細胞增殖和侵襲的影響

魏 峰,張 錦,張逸群,鄭 蓉

(湖北醫藥學院附屬太和醫院婦科，湖北十堰 442000)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌[1]。卵巢癌患者確診時多為晚期，且復發率很高，預后較差[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的長鏈RNA，由RNA聚合酶Ⅱ參與合成[3]。近年的研究表明，lncRNA具有影響基因表達的功能，廣泛參與調控增殖、分化、侵襲等細胞形態和功能的改變。lncRNA與腫瘤特別是卵巢癌的發生發展密切相關[4]。CTD-3162L10.1是一種新發現的lncRNA，其在卵巢癌中的作用機制尚不明確。本研究旨在檢測CTD-3162L10.1在卵巢癌組織和細胞株的表達，分析CTD-3162L10.1與卵巢癌發生的相關性，并通過高表達CTD-3162L10.1，觀察CTD-3162L10.1對卵巢癌細胞增殖和侵襲能力的影響及探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本 23對卵巢癌組織及相應癌旁組織(距癌灶邊緣>5 cm)取自2016-2018年于婦科行手術切除的卵巢癌患者，術后經兩位以上病理醫生確診為卵巢癌。年齡43～71歲，平均(48.92±7.23)歲。所有卵巢癌患者術前均未接受放、化療或生物靶向治療。研究方案經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2細胞株和主要試劑 人正常卵巢上皮細胞IOSE80和卵巢癌細胞株A2780、SKOV-3、HO-8910、OC3、OVCAR-3購自中國科學院上海細胞庫。LipofectamineTM2000、RPMI-1640培養基、DMEM培養基和基質膠購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；空載質粒和表達CTD-3162L10.1的質粒購自廣州銳博生物科技有限公司；實時定量聚合酶鏈式反應(qPCR)引物購自北京擎科生物科技有限公司；qPCR試劑盒購于日本TaKaRa公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒和細胞裂解液NP40購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；β-肌動蛋白(β-Actin)、信號素3B(SEMA3B)、胰島素樣生長因子結合蛋白6(IGFBP-6)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)蛋白抗體購自美國Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與轉染 在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中，OC3、OVCAR-3細胞株培養在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，A2780、SKOV-3、HO-8910、IOSE80細胞株培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中。接種對數生長期的OVCAR-3細胞至6孔板，將細胞分為對照組和實驗組，分別轉染空載質粒和表達CTD-3162L10.1的質粒，以50 ng/mL的濃度進行轉染，轉染操作嚴格依據LipofectamineTM2000說明書。轉染12 h后棄去轉染培養基，添加新鮮培養基。

1.2.2qPCR檢測細胞中CTD-3162L10.1和SEMA3B mRNA的表達 采用TRIzol法提取組織和細胞總RNA，紫外分光光度法檢測RNA濃度和純度，逆轉錄合成cDNA。依據qPCR說明書進行檢測，反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40個循環。qPCR引物見表1。CTD-3162L10.1和SEMA3B mRNA表達量檢測以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參。Ct值以2-ΔΔCt方法進行計算，代表CTD-3162L10.1和SEMA3B mRNA的相對表達量。

1.2.3MTT法檢測兩組OVCAR-3細胞的增殖能力 將對照組和實驗組OVCAR-3細胞以5×103個/孔接種于96孔板，分別于接種后第1、2、3、4、5天采用MTT法檢測細胞的增殖能力。檢測時在每孔，加16 μL MTT試劑，在培養箱中培養4 h后，棄上清后加200 μL二甲基亞砜，搖床振蕩20 min，采用酶標儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光度(A)值。檢測5次后，繪制生長曲線。

1.2.4Transwell侵襲實驗檢測兩組OVCAR-3細胞的侵襲能力 在Transwell小室上室底部加50 μL 濃度為0.2 μg/μL 的基質膠，在培養箱中孵育30 min，保證基質膠凝固。將對照組和實驗組OVCAR-3細胞消化、離心后，采用無血清RPMI-1640培養基重懸細胞，并調整細胞密度為2×105個/mL。將OVCAR-3細胞以4×104個/孔接種于Transwell上室，在 Transwell下室加600 μL含血清RPMI-1640培養基，培養箱中培養24 h。次日，采用甲醛固定30 min,采用結晶紫染液染色30 min，流水沖去多余染液，采用棉簽擦去未穿過底膜的細胞。在倒置顯微鏡下，隨機選5個視野下，計數穿膜細胞數并取均值。

表1 qPCR引物序列

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測SEMA3B及下游蛋白表達 采用細胞裂解液NP40裂解對照組和實驗組OVCAR-3細胞并提取總蛋白，對照組和實驗組分別以50 μg的蛋白上樣量行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳2 h，硝酸纖維膜轉膜2 h，5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，一抗在4 ℃冰箱內內孵育12 h，二抗在室溫下孵育1 h，滴加增強化學發光液，顯影、拍照。

2 結 果

2.1卵巢癌組織和癌旁組織中CTD-3162L10.1表達量 采用qPCR測得卵巢癌組織和癌旁組織中CTD-3162L10.1的表達量分別為(1.05±0.35)和(7.28±1.67)，CTD-3162L10.1在卵巢癌組織中呈低表達(P<0.05)。

2.2卵巢癌細胞株和人健康卵巢上皮細胞CTD-3162L10.1表達量 與人健康卵巢上皮細胞IOSE80相比，卵巢癌細胞株A2780、SKOV-3、HO-8910、OC3、OVCAR-3中CTD-3162L10.1均呈低表達(P<0.05)，OVCAR-3細胞表達量最低(P<0.05)。

2.3CTD-3162L10.1轉染效率測定 對照組和實驗組OVCAR-3細胞中CTD-3162L10.1相對表達量分別為(1.00±0.03)和(6.91±0.58)，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，實驗組細胞中CTD-3162L10.1的表達量增加。

2.4高表達CTD-3162L10.1對OVCAR-3細胞增殖能力的影響 MTT法結果顯示，與對照組相比，實驗組OVCAR-3細胞從3 d開始，增殖能力明顯降低(P<0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1CTD-3162L10.1對卵巢癌細胞OVCAR-3增殖的影響

2.5過表達CTD-3162L10.1對細胞侵襲影響 對照組和實驗組OVCAR-3細胞侵襲細胞數分別為(99.95±11.50)個和(47.65±10.62)個，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，轉染CTD-3162L10.1后的卵巢癌細胞侵襲能力明顯降低。

2.6CTD-3162L10.1對兩組細胞中SEMA3B mRNA表達的影響 對照組和實驗組OVCAR-3細胞中SEMA3B mRNA相對表達量分別為(1.01±0.07)和(4.16±0.34)，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，實驗組細胞中SEMA3B mRNA的表達顯著降低。

2.7過表達CTD-3162L10.1對SEMA3B蛋白及AKT通路蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與對照組相比，轉染CTD-3162L10.1后，SEMA3B、IGFBP-6蛋白的表達量增加，AKT蛋白表達無明顯改變，p-AKT蛋白表達量降低。見圖2。

圖2 Western blot檢測CTD-3162L10.1下游蛋白的表達

3 討 論

卵巢癌具有易轉移和易復發的特點，患者5年生存率小于30%[5]。尋找潛在的分子標志物及針對卵巢癌增殖和遷移分子機制的研究非常重要。lncRNA長久以來被認為是基因轉錄過程的隨機產物，不具有調控細胞活動的功能[6]。然而，最近的研究發現，lncRNA可通過調控靶基因的表達，在卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發生、發展進程中發揮重要調控作用[7-10]。有研究表明，SNHG3、CCAT1、TP73-AS1、EBIC等多種lncRNA 在卵巢癌中表達增加，作為癌基因促進卵巢癌細胞生長、浸潤和轉移，與卵巢癌患者的不良預后密切相關[11-14]。另有研究表明，TUBA4B等lncRNA在卵巢癌中表達降低，作為抑癌基因抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲[15]。CTD-3162L10.1是一種新發現的lncRNA，由2 304個核苷酸組成，CTD-3162L10.1在卵巢癌中的研究未見報道。

本研究結果發現，CTD-3162L10.1在卵巢癌組織和細胞株中均呈低表達，表明CTD-3162L10.1可能作為抑癌基因參與卵巢癌的發生、發展，CTD-3162L10.1可能具有分子診斷標志物的潛力。MTT法和Transwell侵襲實驗進一步表明，高表達CTD-3162L10.1可抑制卵巢癌OVCAR-3細胞的增殖能力和侵襲能力，CTD-3162L10.1在卵巢癌中發揮抑癌基因的作用。SEMA3B定位于染色體3p21.3，屬于信號素家族成員，是一種分泌型蛋白質，由749個氨基酸構成[16]。SEMA3B是一種腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[17]。SEMA3B可通過促進IGFBP-6的表達，抑制AKT信號通路的磷酸化，發揮腫瘤抑制作用[16-18]。有研究表明，SEMA3B在卵巢癌中表達明顯降低[19]。本研究結果發現，OVCAR-3細胞高表達CTD-3162L10.1后，SEMA3B蛋白的表達增加，表明CTD-3162L10.1可直接或間接促進SEMA3B蛋白的表達。SEMA3B蛋白表達增加后，IGFBP-6蛋白的表達增加，AKT信號通路的磷酸化程度降低。AKT信號通路的磷酸化程度可明顯促進腫瘤的增殖和侵襲[20]。高表達CTD-3162L10.1通過上調SEMA3B基因的表達，抑制AKT信號通路的磷酸化，導致卵巢癌細胞增殖和侵襲能力降低。本研究的不足之處在于，CTD-3162L10.1調控SEMA3B的具體作用機制尚不明確，有待進一步的研究。

4 結 論

綜上所述，本研究發現CTD-3162L10.1在卵巢癌組織和細胞株中均呈低表達，CTD-3162L10.1通過靶向SEMA3B干擾AKT信號通路的磷酸化，抑制卵巢癌的增殖和侵襲，表明CTD-3162L10.1在卵巢癌中作為抑癌基因發揮調節作用，為卵巢癌的分子靶向治療提供了新的思路。