SMPD1基因多態性與帕金森病發病關系的研究

熊小琴,張琳靜,陳元東

(黃州區人民醫院：1.檢驗科;2.腫瘤內科，湖北黃岡 438000)

帕金森病(PD)系指黑質和黑質-紋狀體通路變性所引發的一種錐體外系疾病，好發于老年人，以靜止性震顫、行動遲緩、姿勢不穩及肌強直等為主要臨床表現，目前對PD發病機制仍未完全明確，普遍認為與遺傳、環境及衰老等因素有關[1]；近來有研究證實PD發病與一些基因突變密切相關，目前國內外學者已克隆出約18個PD致病基因，其中SMPD1基因被證實在PD發病中起到一定作用[2-3]，研究報道SMPD1基因突變最早出現在尼曼-匹克病中，尼曼-匹克病是一種隱性溶酶體貯積病[4]，而國外學者研究已證實SMPD1基因突變會導致溶酶體功能喪失，引發體內α突觸核蛋白聚合及路易小體沉積，從而導致PD發病[5]。然而，目前國內有關SMPD1基因多態性與PD發病的關系尚不完全明確，本文比較PD患者及體檢健康者SMPD1基因多態性，旨在探究SMPD1基因多態性在PD疾病診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年6月至2019年1月本院神經內科收治的216例PD患者(PD組)和同期在本院體檢的216例體檢健康者(健康組)作為研究對象，PD患者入選標準：(1)符合英國BrainBank標準[6]有關PD診斷標準；(2)排除有PD家族病史；(3)本研究獲得入選PD患者及健康體檢者知情同意；(4)年齡35～85歲。排除標準：(1)繼發性PD患者；(2)合并有腦血管疾病或其他全身嚴重疾病；(3)其他椎體外系疾病或神經系統疾病；(4)健康組既往無PD家族史。PD組216例，男116例，女100例，年齡35～84歲，平均(59.68±4.26)歲，病程1～12年，平均病程(5.26±1.03)年；健康組中男性115例，女性101例，年齡36～85歲，平均(60.08±4.19)歲，PD組和健康組性別、年齡基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。PD組和健康組都來自同一地區且均為漢族。

1.2方法

1.2.1DNA提取 納入受試者均采集2 mL肘靜脈血，采用血液基因組DNA提取試劑盒對全血基因組的DNA進行提取，并溶于50～100 μL的無菌雙氧水中，采用超微量分光光度計檢測DNA的純度及濃度，保存于-20 ℃冰箱待測。

1.2.2SMPD1基因多態性分析 其中PD組患者采用PCR擴增及DNA測序，PCR擴增條件及具體操作步驟參照文獻[7]設計SMPD1基因引物序列，引物序列：(1)SMPD1-1F的引物序列：CCG AGA GAT CAG CTG TCA GA，堿基數20；(2)SMPD1-1R的引物序列：TAG ATG CCA CCC TCT CCA TC，堿基數20；(3)SMPD1-2F的引物序列：GTT ACA GGG CAA TAT CTG GAA G，堿基數22；(4)SMPD1-2R的引物序列：ACA CCA TAT CAA AAG GGC CG，堿基數20；(5)SMPD1-3F的引物序列：ACT GTG AGC TCC TTG CAG GT，堿基數20；(6)SMPD1-3R的引物序列：TGC TCA AGG GAA TTT TCA GC，堿基數20；(7)SMPD1-4F的引物序列：GGG GAG GCT CCT CAC TAG AA，堿基數20；(8)SMPD1-4R的引物序列：AGC TCC AGG AAA GGA GAA GG，堿基數20；PCR反應體系共包含25 μL，1 μL Taq DNA聚合酶，1 μL DNA模板(30 ng/μL)，上下游引物各0.5 μL，2.5 μL 10×PCR緩沖液(含有MgCl2)和15 μL 2.5 mmol/L dNTP，無菌雙蒸餾水補足至30 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共15個循環；94 ℃ 20 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共循環25次；72 ℃ 7 min，4 ℃保持。取PCR產物及負載染料混勻，行1%瓊脂糖凝膠電泳，D100標志物為標準對照，在紫外分光光度計明確擴增產物質量，將質量符合要求的未純化PCR產物，引物合成和測序都由北京大華大基因研究中心有限公司完成。健康組受試者在PCR擴增產物中加入AlwNI內切酶，在37 ℃酶切過夜，采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳將酶切產物分開，采用EB染色后于紫外燈下進行觀察和分析。

1.2.3基因序列對比及生物信息學分析 在美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站中利用Blast軟件進行比對，參照對比結果判斷基因是否存在突變。生物信息學分析在SIFT、IMutant2.0及MUpro網站中進行，分析SMPD1基因上新的突變點對其編碼溶酶體酶SMase穩定性的影響。運用Mutation Taster及PolyPhen2檢測突變點的致病性。

1.2.4Hardy-Weinberg遺傳平衡定律吻合度檢驗 溫伯格定律系指在一個不發生基因突變、人口遷移和自然選擇的，無限大的且相互交配的群體當中，基因頻率和基因型頻率將保持不變，是群體遺傳學中重要原理之一，解釋了生物繁殖如何影響群體基因及基因型頻率。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0對研究數據進行分析和處理，計數資料采取率(%)表示，采用χ2檢驗驗證兩組受試者是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，同時檢驗PD組與健康組等位基因不同基因型頻率分布差異，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組基因的Hardy-Weinberg遺傳平衡定律吻合度檢驗 PD組基因型與健康組基因型均符合Hardy-Weinberg定律。

2.2SMPD1各基因位點在PD組和健康組中的最小等位基因頻率分布 研究發現在PD組和健康組均發現4個已知的多態位點(p.A36V、p.D212D、p.P332R、p.G508R)，僅rs1050239位點中，兩組等位基因頻率比較差異有統計學意義(OR=1.270，95%CI：1.028～1.572，P=0.000)，見表1。

表1 SMPD1各基因位點在PD組和健康組中的最小等位基因頻率分布

2.3各多態位點基因型頻率及等位基因頻率在兩組中分布檢測結果 rs1050228位點兩組均有TT、CT、CC這3種基因，PD組TT、CT、CC基因頻率、等位基因T、C頻率(分別為73.15%、5.56%、21.30%、76.07%、23.93%)與健康組(分別為72.22%、6.02%、21.76%、78.03%、21.97%)相比較差異均無統計學意義(P>0.05)；rs7951904位點的CC、CT基因頻率、等位基因C、T頻率(分別為99.07%、0.93%、99.64%、0.36%)與健康組(分別為99.54%、0.46%、99.81%、0.19% )比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；rs202081954位點的CC、CG基因頻率、等位基因C、G頻率(分別為99.07%、0.93%、99.64%、0.36%)與健康組(分別為99.54%、0.46%、99.81%、0.19% )比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；rs1050239位點的等位基因G、A頻率(分別為81.43%、18.57%)與健康組(分別為91.62%、8.38%)比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2、3。各多態性位點DNA測序圖見圖1～4。

表2 多態位點基因型頻率在兩組中分布檢測結果

表3 各多態位點等位基因頻率在兩組中分布檢測結果

續表3 各多態位點等位基因頻率在兩組中分布檢測結果

注：A為基因突變點TT、B為基因突變點CC、C為基因突變點CT，箭頭所示均為突變位點

圖1rs1050228多態性位點DNA測序圖

注：A為突變位點CC、B為突變位點CT、箭頭所示均為突變位點

圖2rs7951904多態性位點DNA測序圖

注：A為突變位點CC、B為突變位點CG

圖3rs202081954多態性位點DNA測序圖

2.4纈氨酸重復次數多態分析 研究發現PD組和健康組均發現纈氨酸重復次數的多態。發現PD組纈氨酸重復次數分布概率與健康組相比較，差異有統計學意義(χ2=25.264，P<0.05)，見表4。纈氨酸重復次數的多態見圖5。

注：A為突變位點GG、B為突變位點AA、C為突變位點AG

圖4rs1050239多態性位點DNA測序圖

表4 纈氨酸重復多態在PD組和健康組的分布情況[n(%)]

注：A表示n=5(c.107-118deITGCTGGCGCTGG)、B表示n=6(c.108-113delGCTGGC)、C表示n=7、D表示n=9(c.143-144insGC TGGCGCTGGC)

圖5纈氨酸重復次數的多態

3 討 論

黑質致密部多巴胺能神經元變性、脫失及細胞內泛素、α突觸核蛋白為主要成分路易小體形成等是PD主要病理學特征，到目前為止PD病因及發病機制尚未完全明確，國內外不少學者研究證實許多易感基因通過不同路徑損害細胞新陳代謝從而導致PD發病風險明顯升高[8-9]，細胞溶酶體自我吞噬通路是PD發病機制中一種重要的途徑，有研究指出SMPD1參與了神經酰胺產生，其表達缺陷會引發自噬溶酶體功能障礙，與溶酶體貯積癥密切相關，提示SMPD1可能對PD診斷有一定價值[10]；馬艷等[11]學者研究證實原發性PD患者AMPD1基因存在p.A402T位點突變，并且這一位點突變會增加PD發病風險；FOO等[12]學者研究從198名受試者的序列中，發現了4種罕見的SMPD1(p.p332r、p.y500h、p.p533l和p.r591c)突變體，并且這些突變體只出現在PD患者中，并未在對照組受試者中出現。

一直以來臨床對PD診斷主要依據患者臨床癥狀，尚缺乏客觀的診斷PD的實驗室診斷依據，而SMPD1在PD發病中有一定作用，考慮SMPD1基因多態性可能在PD診斷中有一定價值。SMPD1主要位于11號染色體上，其蛋白產物為酸性鞘磷脂酶，為一種溶酶體酶(可產生神經酰胺)，SMPD1基因突變后其產物活性明顯降低，引發溶酶體底物積聚，中樞神經系統及其他器官細胞功能喪失[13]。本研究對216例PD患者及216例健康體檢者的SMPD1基因進行了測序，兩組均檢出4個已知單核苷酸多態(SNP)及纈氨酸重復次數多態，4個SNP中p.A36V、p.P332R、p.G508R 3個是錯義的，p.D212D為同義，并發現PD組和健康組p.G508R等位基因頻率比較，差異有統計學意義(OR=1.270，95%CI：1.028～1.572，P=0.000)，此外PD組纈氨酸重復次數分布概率與健康組相比較差異有統計學意義，尤其是當纈氨酸重復次數<7時PD發病風險更高。SMPD1基因全長共4 685 bp，含有6個外顯子和5個內含子，編碼產物由629個氨基酸組成的鞘磷脂酸性二酯酶1，屬于一種溶酶體酶，其可裂解鞘磷脂膽堿磷酸頭基，產物神經酰胺在壓力作用下作為第二信使從而啟動凋亡反應，促進PD病理發展[14]，此外以往有研究在NPD患者中同樣發現了纈氨酸重復次數的多態[15]，并且纈氨酸序列位于酸性鞘磷脂酶的疏水核心區域，而本研究初步證實了SMPD1基因多態性在PD和健康者中比較差異有統計學意義(P<0.05)，SMPD1基因多態性在PD診斷中有積極作用，與李芳[16]學者的研究報道的觀點大體上相符。

本研究中共檢出4種已知的SMPD1基因位點，其中p.G508R基因及纈氨酸重復次數<7可作為預測PD是否發生的有效指標，為PD的實驗室診斷提供可靠依據。

4 結 論

本文通過對SMPD1基因多態性與PD發病關系的研究，初步明確了SMPD1基因突變型p.G508R及纈氨酸<7個重復多態在PD發病中的重要作用，為PD臨床診治提供更多的決策支持，為PD患者解除疾病困擾。