利用GeneXpert 法檢測耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥基因及耐藥性分析*

宋林鍵,葉麗艷,趙 強,沈躍云,羅燕萍

(解放軍總醫院第一醫學中心醫學檢驗中心，北京 100853)

隨著抗菌藥物在臨床治療中的廣泛應用，在抗菌藥物的選擇壓力下，細菌的耐藥能力逐漸增強，多藥耐藥菌的檢出率也逐年上升[1]。其中，耐碳青霉烯類抗菌藥物細菌的出現和傳播，引起了廣泛的關注。作為抗菌譜最廣，抗菌活性最強的第三線臨床抗感染藥物，碳青霉烯類抗菌藥物常用于治療產超廣譜β-內酰胺酶和頭孢菌素酶的腸桿菌科細菌所引起的感染。但近年來，耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細菌(CRE)已經出現并呈上升趨勢，其中以肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌最為嚴重，這給相關細菌感染的控制和治療帶來了諸多困難。因此，快速準確地了解鑒定耐藥基因的類型，對臨床治療及預防耐藥菌的傳播具有重要的意義。

GeneXpert Carba-R?系統由美國Cepheid研發、生產的核酸提取擴增檢測一體化系統，可在體外快速定性或定量檢測感染性疾病病原、耐藥性基因及腫瘤基因等，結果高度準確，可及時為臨床決策提供診療依據[2]。已有研究結果表明賽沛 GeneXpert Carba-R?全自動病原體快速檢測系統能快速準確的檢測出耐碳青霉烯酶基因[3-5]。為快速鑒定耐碳青霉烯類抗菌藥物及其攜帶的耐藥基因，也為指導臨床醫生合理用藥提供早期依據，現將本院2016年3月至2017年 10月利用GeneXpert Carba-R?全自動病原體快速檢測系統檢出的非呼吸道標本中的CRE菌株的分布和耐藥基因特點分析結果如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集 2016年3 月至 2017年10月本院臨床患者的非呼吸道標本(尿液、引流液、靜脈血、膽汁等)中分離出的亞胺培南耐藥的腸桿菌科菌株。同一患者，同一部位的標本只收集1株。細菌分離鑒定按《全國臨床檢驗操作規程》要求執行。質控菌株為大腸埃希菌 ATCC25922。

1.2儀器與試劑 全自動快速微生物質譜檢測系統VITEK MS和VITEK 2 Compact型全自自動微生物鑒定藥敏儀(法國生物梅里埃公司)，GeneXpert Carba-R?全自動病原體快速檢測系統(美國賽沛公司)。

1.2.1菌株鑒定和藥敏試驗 收集141株菌株，利用全自動快速微生物質譜檢測系統VITEK MS進行細菌鑒定。同時采用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定和藥敏分析系統對分離菌株進行藥敏試驗，檢測其對阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢他啶、亞胺培南、慶大霉素、復方磺胺甲噁唑的耐藥情況。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2.2細菌耐藥相關基因檢測 用含有Xpert Carba-R的試劑盒將菌株在Cepheid GeneXpert Ⅳ系統上進行分析[4]。采用中國藍平板培養141株CRE細菌，挑取單個菌落，使用生理鹽水分別配置成0.5麥氏濃度的菌懸液，將10 μL菌懸液加入GeneXpert Carba-R?樣本試劑中混勻，將混勻后的液體15 mL加入到試劑盒中，掃碼上機，采用全自動病原體快速檢測系統，48 min后讀取結果。

1.3統計學處理 采用世界衛生組織(WHO)推薦的WHONET5.6軟件對菌株分布及藥敏結果進行統計分析。SPSS17.0軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CRE分布情況

2.1.1標本來源分布 141株CRE主要來源為尿液37株(26.2%)，引流液32株(22.7%)，靜脈血21株(14.9%)，導管17株(12%)，膽汁11株(7.8%)，傷口分泌物7株(5%)，組織7株(5%)，胸腔積液4株(2.8%)，其他標本來源5株(3.5%)。

2.1.2菌種分布 肺炎克雷伯菌最多(114株)，占總數的81%，與文獻報道的耐藥菌株流行情況一致[5]。大腸埃希菌13株(9%)，陰溝腸桿菌8株(6%)，弗氏枸櫞酸桿菌3株(2%)，產氣腸桿菌2株(1%)，魏氏檸檬酸桿菌1株(1%)。

2.2CRE的耐藥基因分布 141株CRE中，使用Xpert Carba-R?的試劑盒，共檢測出blaKPC103株，檢出率為73%；blaNDM22株，檢出率為15.6%；blaOXA-484株，檢出率為2.8%；含兩種及兩種以上耐藥基因12株，檢出率為8.5%。菌株基因型詳細分布見表1。

表1 141株CRE耐藥基因分布情況(n)

2.3藥敏結果 141株CRE對除碳青霉烯類抗菌藥物以外的常見8種抗菌藥物的藥敏結果見表2。將113株含耐藥基因的肺炎克雷伯菌與28株含耐藥基因的其他腸桿菌科細菌耐藥率結果進行對比，結果見表3。將攜帶耐藥基因blaKPC(103 株)、blaNDM(22 株)的藥敏結果進行對比，結果見表4。

表2 141株CRE的藥敏結果(%，n)

表3 肺炎克雷伯菌與其他腸桿菌科細菌藥敏結果

表4 blaKPC、blaNDM感染的菌株藥敏結果耐藥對比

3 討 論

細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制主要包括產碳青霉烯酶、外膜蛋白的缺失或改變及主動外排泵機制，其中以產碳青霉烯酶耐藥為主[7]。本試驗中檢測的KPC酶屬于由質粒介導的A類碳青霉烯酶；IMP、VIM及NDM酶屬于由質粒介導的B類金屬酶。OXA48屬于D類苯唑西林酶[8]，其中KPC型最多[9]。

本院141株非呼吸道來源的標本中分離出的CRE中，blaKPC基因的檢出率高達73%，廣泛存在于各標本中，96%為肺炎克雷伯菌。與2013年中華醫療感染雜志的報道相符[10]。其次blaNDM基因檢出率為15.6%，多分布于尿液標本，僅有兩株為肺炎克雷伯菌，其余20株均為其他腸桿菌科細菌，分別是大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌及魏氏枸櫞酸桿菌。這與文獻報道一致[11]。blaOXA-48檢出率僅為2.8%，標本來源于靜脈血、導管、分泌物。菌種來源于肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌及陰溝腸桿菌。blaKPC基因和blaNDM基因先后從肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中首次發現，后通過質粒或移動元件介導的基因的水平轉移廣泛流行于腸桿菌中，造成了碳青霉烯耐藥性的廣泛傳播。近年來，blaKPC基因和blaNDM基因在檢出率逐年上升。在英國、美國、哥倫比亞、比利時、中國、法國、日本、希臘、巴西、波蘭、阿根廷及意大利等國家是重度流行國家，這些現象或許與抗菌藥物的不合理使用及特定時間人口的遷徙有關。值得注意的是本研究中還出現了8株攜帶兩種碳青霉烯酶基因和1株攜帶上述3種碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌。混合基因型中以攜帶blaKPC和blaOXA-48基因為主，而且混合基因型主要來自肺炎克雷伯菌。這種多種碳青霉烯酶基因共存的現象，更進一步說明了在抗菌藥物選擇的壓力下，菌株存在多種耐藥基因共存。

141株CRE對亞胺培南、氨芐西林、頭孢唑林、厄他陪南、氨芐西林/舒巴坦全耐藥，其他抗菌藥物的耐藥率由高到低依次為頭孢他啶、氨曲南、頭孢吡肟、環丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、復方磺胺甲噁唑。其中慶大霉素、阿米卡星和復方磺胺甲噁唑的耐藥率較低。不同菌株類型及攜帶不同耐藥基因種類統計學分析結果顯示攜帶耐藥基因的肺炎克雷伯菌與其他腸桿菌科細菌在氨曲南、環丙沙星、頭孢吡肟、左氧氟沙星這4種抗菌藥物耐藥率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。這就說明在不明確菌株耐藥基因的條件下，以上4種抗菌藥物可能對治療除肺炎克雷伯菌以外的腸桿菌科細菌感染可能有效。攜帶blaKPC，blaNDM耐藥基因的菌株藥敏結果分析中顯示其在阿米卡星、氨曲南、環丙沙星、頭孢吡肟、復方磺胺甲噁唑這5種抗菌藥物耐藥率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。尤其攜帶blaNDM耐藥基因的菌株對阿米卡星的耐藥率僅為13.6%。研究結果顯示不同細菌種類，不同的耐藥基因對抗菌藥物的耐藥情況不同。這就表明在含有耐藥基因的CRE中，用藥時要綜合考慮細菌種類及所含耐藥基因類型。

綜上所述，本研究利用GeneXpert Carba-R?全自動病原體快速檢測系統檢測出blaNDM4例，混合耐藥基因blaKPC+blaNDM3例，blaKPC+blaOXA-487例，blaIMP+blaOXA-481例，blaKPC+blaNDM+blaOXA-481例。GeneXpert Carba-R?用時短，操作簡單，可在40 min內快速檢測碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的耐藥基因，及時準確地將結果反饋給臨床，為指導臨床合理用藥及預防耐藥菌株的流行具有極其重要的意義，缺點在于試劑盒費用較高。Carba-R試劑盒可以直接利用標本進行快速基因鑒定，不需要對標本進行培養[12]。快速檢測技術為耐藥基因的檢測提供了更好的方法，并為及時實施感染防治措施作出了貢獻[13-14]。同時，本研究試驗結果顯示：攜帶不同耐藥基因的腸桿菌科細菌其用藥應有所不同。快速、準確地檢測出耐藥基因不僅有利于掌控院內耐藥基因流行趨勢；同時為醫生針對不同患者合理用藥提供依據。面對CRE威脅，醫療機構應了解患者CRE感染危險因素，采取相應的干預措施[15-16]，制定并落實防控CRE感染策略，保障醫療安全，做好醫院感染控制工作。

4 結 論

GeneXpert Carba-R?全自動病原體快速檢測系統可快速實時監測含不同耐藥基因的CRE分布趨勢和流行特點，可即時發現并預防耐藥基因的暴發流行，便于臨床醫生針對不同的耐藥基因表型進行合理用藥。