哮喘小鼠中髓樣抑制細(xì)胞及Arg-1、iNOs的表達(dá)①

余孟珠 李 莉 薛 菲 單文琪 呂劍平 汪雪峰

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科,鎮(zhèn)江 212001)

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，嚴(yán)重危害兒童身心健康。其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但細(xì)胞因子在該炎癥中所起的重要作用已受到國內(nèi)外學(xué)者越來越多關(guān)注。髓樣抑制細(xì)胞(Myeloid derived suppressor cells，MDSCs)是20世紀(jì)80年代在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一群異質(zhì)性細(xì)胞群，源自骨髓祖細(xì)胞及未成熟髓細(xì)胞，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能[1，2]。MDSCs分兩個亞群，一類為單核細(xì)胞樣MDSC(M-MDSC)，表達(dá)CD11b+Ly6G-Ly6Chigh表型，另一類為粒細(xì)胞樣MDSC(G-MDSC)，表達(dá)CD11b+Ly6G+Ly6Clow表型[3]。隨著深入研究，MDSCs不僅在腫瘤發(fā)展中扮演重要角色，而且在病毒感染、敗血癥及自身免疫系統(tǒng)疾病中也起著重要作用[4]。國內(nèi)外有研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs在肺部過敏性炎癥中也有高表達(dá)，同時參與哮喘肺部炎癥、氣道高反應(yīng)及氣道重塑發(fā)生發(fā)展[5，6]。研究表明，MDSCs可通過表達(dá)高水平的免疫抑制因子發(fā)揮免疫作用，如：精氨酸酶-1(Arginase-1，Arg-1)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOs)等[7]。目前，MDSCs在哮喘病情進(jìn)展中發(fā)揮作用的機(jī)理尚不明確。本文通過分析哮喘小鼠脾細(xì)胞中MDSCs兩個亞群所占有核細(xì)胞比例，以及MDSCs產(chǎn)物Arg-1、iNOs在小鼠中表達(dá)水平，初步探討MDSCs在哮喘發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選擇6～8周齡雄性BALB/c小鼠，揚州大學(xué)動物研究中心購買[動物合格證號：SCXK(蘇)2017-0007]，實驗中所用小鼠隨機(jī)分為對照組(control)和哮喘組(OVA)進(jìn)行造模，每組20只，所有小鼠均在江蘇大學(xué)實驗動物中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 卵清蛋白(OVA，V級)購自美國Sigma公司；goat anti-mouse IgE購自美國Abcam公司；HRP-conjugated rabbit anti-goat secondary IgE購自中國Multisciences公司；FITC anti-mouse CD11b、PE anti-mouse Ly-6C、APC anti-mouse Ly6G購自美國Biolegend公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；熒光定量PCR試劑盒All-in-oneTMMix購自美國Genecopoeia公司；NOS2 Polycional Antibody、ARG1 Polycional Antibody、GAPDH Polycional Antibody、HRP Goat Anti-Rabbit IgG購自美國ABclonal公司。

1.2方法

1.2.1哮喘模型建立 分別于第1、8和15天，哮喘組小鼠給予腹腔內(nèi)注射抗原混合溶液 0.2 ml(含OVA 50 μg、10%氫氧化鋁)，對照組給予腹腔注射磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS)0.2 ml。第22天開始，哮喘組小鼠每日霧化吸入2% OVA進(jìn)行哮喘激發(fā)，每次30 min，每日1次，持續(xù)至第28天，共計7 d。對照組小鼠給予PBS霧化替代。

1.2.2支氣管肺泡灌洗液收集 結(jié)扎左主支氣管后，取預(yù)冷的PBS緩沖液1 ml，分3次緩慢沖洗右肺，收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，裂解紅細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計數(shù)完成后離心取細(xì)胞沉渣涂片，瑞氏染色后計數(shù)嗜酸細(xì)胞(Eosnophils，EOS)百分比。

1.2.3血清OVA特異性抗體IgE檢測 取小鼠眼球血約1 ml，室溫靜置30 min后，3 000 r/min，離心15 min取上層血清。采用ELISA法檢測血清OVA特異性抗體IgE水平，在450 nm處測吸光度(OD)值。

1.2.4肺組織病理評分 取小鼠左肺組織切片進(jìn)行HE染色，光鏡下進(jìn)行觀察。參考文獻(xiàn)[8]對病理組織切片進(jìn)行炎癥評分。

1.2.5PBMC的提取及MDSCs細(xì)胞檢測 小鼠麻醉處死后，仰臥位固定，暴露腹腔取脾臟，加入Stanning buffer(含2%胎牛血清的PBS溶液)研磨成單個核細(xì)胞，將得到的脾細(xì)胞懸液離心棄上清，加入1 ml buffer重懸細(xì)胞后，每管加入12 ml紅細(xì)胞裂解液，靜置3 min，充分裂解紅細(xì)胞，離心棄上清，洗一遍后進(jìn)行過濾，再次離心棄上清，用buffer洗一遍，重懸后計數(shù)。取每管106個細(xì)胞加入100 μl buffer混勻，分別加入FITC anti-mouse CD11b、PE anti-mouse Ly-6C及APC anti-mouse Ly6G，4℃避光染色30 min，加入buffer洗2遍，加入400 μl的buffer混勻，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6qRT-PCR檢測Arg-1、iNOs mRNA表達(dá) 提取脾細(xì)胞及肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，按照All-in-oneTMMix試劑盒說明書，分別進(jìn)行實時熒光PCR檢測Arg-1、iNOs、GAPDH。用GAPDH對目的基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。引物由美國Genecopoeia公司設(shè)計合成，貨號如下：Arg-1(No.MQP026580)、iNOs(No.MQP029793)、GAPDH(No.MQP027158)。

1.2.7Western blot法檢測Arg-1、iNOs蛋白表達(dá) 提取肺組織蛋白，定量后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉，將配置好的一抗(用1% BSA以1∶1 000稀釋)分別倒入孵育盒，將封閉后用TBST清洗后放入一抗中，4℃過夜，TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗(以1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗滌5次，加入ECL發(fā)光液作用后曝光，最后采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行蛋白條帶的半定量分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以非配對t檢驗分析兩組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組小鼠BALF細(xì)胞計數(shù)和EOS百分比結(jié)果比較 結(jié)果如圖1所示，哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著高于對照組(P均<0.05)。

圖1 BALF細(xì)胞計數(shù)和EOS百分比Fig.1 Number of total cells and proportion of eosinophils in BALFNote:

2.2兩組小鼠血清OVA特異性抗體IgE水平結(jié)果比較 如圖2所示，與對照組相比，哮喘組小鼠血清OVA特異性抗體IgE表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。

圖2 血清OVA特異性抗體IgE水平Fig.2 Level of Anti-OVA-specific IgE in serum of miceNote:

2.3兩組小鼠肺組織病理結(jié)果比較 與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織支氣管管壁增厚，管腔狹窄，肺泡間隔增厚，支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤明顯。炎癥評分較對照組明顯增高(P<0.05)，見圖3。

圖3 肺組織病理切片結(jié)果Fig.3 Pathological section of lung tissue and inflamma-tion scoreNote:

2.4兩組小鼠脾細(xì)胞中MDSCs兩個亞群占有核細(xì)胞比例 流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組小鼠脾細(xì)胞中MDSCs兩個亞群占有核細(xì)胞比例，如圖4所示，哮喘組小鼠脾細(xì)胞中G-MDSC亞群細(xì)胞所占比例明顯高于對照組(P<0.001)，而兩組間M-MDSC亞群無明顯差別(P>0.05)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中MDSCs細(xì)胞比例Fig.4 Percentage of MDSCs were analyzed by flow cytometryNote:

2.5兩組小鼠脾細(xì)胞中Arg-1、iNOs mRNA表達(dá)水平 采用qRT-PCR檢測Arg-1、iNOs mRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，哮喘組小鼠脾細(xì)胞中Arg-1 mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；iNOs mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.001)。

圖5 小鼠脾細(xì)胞中Arg-1、iNOs mRNA的表達(dá)Fig.5 Expression of Arg-1 and iNOs mRNA in spleen of mice Note:

2.6兩組小鼠肺組織中Arg-1、iNOs mRNA表達(dá) 采用qRT-PCR檢測小鼠肺組織中Arg-1、iNOs mRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖6所示，與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織中Arg-1 mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)，iNOs mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.001)。

圖6 小鼠肺組織中Arg-1、iNOs mRNA的表達(dá) Fig.6 Expression of Arg-1 and iNOs mRNA in lung of miceNote:

圖7 小鼠肺組織中Arg-1、iNOs蛋白表達(dá)水平Fig.7 Protein expression of Arg-1 and iNOs in lung of miceNote:

2.7兩組小鼠肺組織中Arg-1、iNOs蛋白表達(dá) 采用Western blot法檢測小鼠肺組織中Arg-1、iNOs蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織中Arg-1蛋白水平表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)，iNOs蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.001)。

3 討論

支氣管哮喘是全世界范圍內(nèi)兒童最常見的慢性下呼吸道疾病。本研究中，哮喘組小鼠經(jīng)OVA致敏及霧化激發(fā)后，呈現(xiàn)出明顯的頭面部瘙癢、安靜少動、弓背、前肢抬起、大小便失禁等哮喘急性發(fā)作的表現(xiàn)，其BALF中細(xì)胞總數(shù)、EOS百分比及血清OVA特異性抗體IgE表達(dá)水平與對照組相比明顯增高，肺組織病理切片HE染色顯示，支氣管管壁增厚，管腔狹窄，腔內(nèi)可見大量的黏液，支氣管及血管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，符合哮喘的病理改變，提示哮喘模型制備成功。

MDSCs是骨髓來源的一群異質(zhì)性細(xì)胞，不僅參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和增殖，而且在病毒感染、敗血癥、急慢性非特異性炎癥、哮喘、創(chuàng)傷以及其他自身免疫疾病中起重要作用。支氣管哮喘是一種以多種細(xì)胞浸潤和氣道高反應(yīng)為特征的慢性氣道炎癥性疾病，目前已知與Th1/Th2、Th17/Treg失衡相關(guān)[9,10]，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在反復(fù)喘息患兒外周血中MDSCs比例明顯升高于肺炎組及正常對照組[11]，這與文獻(xiàn)報道MDSCs在哮喘患兒體內(nèi)表達(dá)升高是一致的[12]，然而，哮喘發(fā)病過程中MDSCs具體作用機(jī)制尚不明確。

研究表明，MDSCs可產(chǎn)生高水平的免疫抑制因子Arg-1、iNOs和活性氧(ROS)，而Arg-1和iNOs在抑制T細(xì)胞功能方面的作用已被證實[13]。Arg-1可將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L-鳥氨酸和尿素,iNOs可產(chǎn)生NO。MDSCs產(chǎn)生的Arg-1活性增加可導(dǎo)致L-精氨酸分解代謝增強(qiáng)，進(jìn)而從微環(huán)境中消耗這種非必需氨基酸，而L-精氨酸與T細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)密切相關(guān)。L-精氨酸缺乏抑制T細(xì)胞增殖可通過不同的途徑，包括減少T細(xì)胞受體(TCR)CD3ζ鏈的合成以及TCR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙等[7]。NO與O2-合成具有強(qiáng)氧化能力的過氧亞硝酸鹽(ONOO-)，可導(dǎo)致TCR和CD8分子的硝化，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡。

本研究中兩組小鼠脾細(xì)胞中MDSCs細(xì)胞比例結(jié)果顯示，哮喘組G-MDSC與對照組相比明顯升高，M-MDSC亞群結(jié)果比較兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測MDSCs在哮喘發(fā)展中可能由G-MDSC亞群起主要作用。盡管大多文獻(xiàn)報道MDSCs高表達(dá)Arg-1、iNOs[14]，但也有文獻(xiàn)報道MDSCs表達(dá)的Arg-1、iNOs存在差異，例如，王瑞等[15]發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠中MDSCs產(chǎn)物iNOs的表達(dá)升高，Arg-1的表達(dá)降低。而我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，哮喘組小鼠脾細(xì)胞及肺組織中Arg-1 mRNA表達(dá)均升高，iNOs mRNA表達(dá)均減少，且在小鼠肺組織中Arg-1及iNOs蛋白表達(dá)水平與此是一致的。由此推測，不同疾病狀態(tài)下機(jī)體微環(huán)境變化可能影響Arg-1和iNOs的表達(dá)，MDSCs可能通過高表達(dá)Arg-1參與哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)。也有研究表明，IL-4和IL-13可誘導(dǎo)產(chǎn)生Arg-1，IFN-γ可誘導(dǎo)產(chǎn)生iNOs[16]。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-12和TNF-β，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等，哮喘狀態(tài)下存在Th1/Th2失衡，低表達(dá)的Th1細(xì)胞因子、高表達(dá)的Th2細(xì)胞因子是否誘導(dǎo)了Arg-1的高表達(dá)，抑制了iNOs的低表達(dá)，需要進(jìn)一步實驗研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示MDSCs尤其是G-MDSC亞群參與哮喘氣道炎癥反應(yīng)，MDSCs可能通過高表達(dá)Arg-1、低表達(dá)iNOs參與哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)，需要進(jìn)一步實驗明確MDSCs及其Arg-1、iNOs產(chǎn)物對哮喘發(fā)病過程中T細(xì)胞反應(yīng)的影響，從而為以MDSCs為靶點的哮喘治療提供實驗依據(jù)。