腎上腺髓質素通過PI3K/Akt信號通路影響人牙髓干細胞增殖和凋亡的研究①

李文靜 李浩渤 王菲菲 劉從娜 郭 晗 王 燕

(河北醫科大學第二醫院口腔內科，石家莊 050000)

當牙體組織受到外傷、齲病等因素而損傷牙髓時，部分成牙本質細胞受到損傷發生變性，變性的牙本質細胞可由牙髓未分化間充質細胞代替形成牙本質，保護牙髓。牙髓中的牙髓干細胞具有多向分化潛能，可分化為成牙本質細胞、脂肪細胞、肌細胞、骨細胞等多種細胞，牙髓干細胞的增殖和分化在牙本質的修復性形成中具有重要作用，因此探討牙髓干細胞增殖和凋亡的機制具有重要意義[1,2]。腎上腺髓質素具有誘導成骨、調節細胞凋亡、調節炎癥反應、促進血管生成、促進細胞遷移等多種效應，在牙本質基質形成和牙齒發育中具有重要作用[3,4]，有研究發現腎上腺髓質素可促進牙髓干細胞的增殖和分化[5]，但其通過哪種信號通路促進牙髓干細胞增殖尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路在細胞增殖和凋亡中發揮重要作用，參與多種細胞的增殖和凋亡[6]。 本文對腎上腺髓質素對人牙髓干細胞增殖和凋亡以及PI3K/Akt信號通路的影響進行研究，探討腎上腺髓質素在牙髓干細胞增殖和凋亡中的作用及可能機制，為臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 組織來源：選取我院因正畸需要拔出的恒牙2顆，所選牙無根尖周炎、無齲壞、無牙周炎，且患者簽署知情同意書。主要試劑和儀器：腎上腺髓質素、胰蛋白酶、DMEM培養基、胎牛血清(美國CST公司)，PI3K/Akt通路抑制劑LY294002、四唑鹽(Tetrazolium salt，MTT)試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、細胞凋亡測定試劑盒(Annexin V-FITC/PI)(美國Invitrogen公司)，鼠抗人CD44抗體、鼠抗人CD34抗體、兔抗人增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗體、兔抗人Cleaved Caspase-3多克隆抗體、兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人磷酸化Akt(Phosphorylated Akt，p-Akt)多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體等(美國Sigma公司)等。BD FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)等。

1.2方法

1.2.1牙髓干細胞培養 使用鉗子，將拔除后的離體牙放入液氮中，牙科金剛砂車針將離體牙縱向切開，使用無菌器械鑷子刮取牙髓組織，在DMEM培養基中將牙髓組織剪碎，用Ⅰ型膠原酶水浴消化1.5 h至組織塊松散，離心(1 000 r/min)5 min，棄去上清液，加入FBS培養基吹打成混懸液，移入6孔板中培養，隔日進行半量換液，收集細胞的培養上清液離心(1 000 r/min)10 min，加入含FBS的DMEM培養基進行原代培養，培養至出現細胞克隆，挑選細胞克隆轉移到96孔板中培養，達一定數量后依次轉移到24孔板中、6孔板中、培養瓶中培養，細胞達85%融合后進行胰酶消化傳代。

1.2.2牙髓干細胞鑒定 將生長良好的第三代牙髓干細胞用胰酶消化，用培養基重懸調整牙髓干細胞濃度為1×108L-1，接種到6孔板中培養，24 h棄去上清液，加入PBS洗滌，干燥后用多聚甲醛固定，PBS洗滌，按免疫組化染色試劑盒說明書檢測牙髓干細胞中CD44和CD34的表達情況，陰性對照組不加一抗進行孵育，陽性對照組加入一抗進行孵育：用山羊血清封閉10 min，加入一抗過夜孵育，加入生物素標記的二抗孵育30 min，加入辣根酶標記鏈霉卵白素孵育30 min，DAB顯色10 min，中性樹膠封片。

1.2.3牙髓干細胞分組及處理 取第三代牙髓干細胞隨機分為對照組、腎上腺髓質素組和腎上腺髓質素+抑制劑組。腎上腺髓質素組培養基中加入濃度為107mol/L的腎上腺髓質素；腎上腺髓質素+抑制劑組培養基中加入濃度為107mol/L的腎上腺髓質素[5]和15 μmol/L的LY294002[7]；對照組培養基不加處理，培養48 h收集細胞。

1.2.4MTT測定牙髓干細胞增殖 將三組細胞調整細胞密度為3×104ml-1接種到96孔板中，每孔200 μl，分別在培養1 d、3 d、7 d加入10 μl MTT試劑孵育4 h，用分光光度計測定波長490 nm處吸光度(A)值。

1.2.5流式細胞術測定牙髓干細胞凋亡 將三組細胞用PBS液洗滌，加入緩沖液重懸細胞，調整牙髓干細胞濃度為1×106ml-1，在流式管中加入100 μl細胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI室溫孵育15 min，上機測定各組牙髓干細胞凋亡情況。

1.2.6Western blot測定牙髓干細胞中PCNA、Cleaved Caspase-3和PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平 取上述三組牙髓干細胞，加入RIPA裂解液裂解牙髓干細胞30 min，離心(12 000 r/min)10 min，收集上清液，測定各組牙髓干細胞蛋白濃度，將各組牙髓干細胞蛋白樣品和上樣液(上樣量30 μg)混合變性5 min，加入到制備好的SDS-PAGE凝膠上樣孔中電泳，轉膜1.5 h，脫脂奶粉封閉2 h，加入PCNA、Cleaved Caspase-3和PI3K、p-Akt、Akt一抗過夜孵育，加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG孵育2 h，ECL顯影，自動凝膠成像系統采集圖像，以β-actin為內參，目標蛋白表達量以目標蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值表示。

2 結果

2.1牙髓干細胞培養 培養72 h 細胞貼壁生長，有小細胞克隆形成，細胞多呈成纖維細胞樣；7 d時有較多細胞從組織塊周圍游離出來。細胞增殖至1 000 個細胞左右時消化傳代，傳代培養細胞呈長梭形，有細胞突起。見圖1。

圖1 牙髓干細胞培養形態特征Fig.1 Morphological characteristics of dental pulp stem cellsNote:A.Primary culture 24 h (×40)；B.Primary culture 7 d (×40)；C.Subculture 3rd generation (×100).

2.2牙髓干細胞鑒定 免疫組化結果顯示牙髓干細胞陽性表達CD44，陰性表達CD34，表明培養細胞為牙髓干細胞。見圖2。

圖2 免疫組化染色鑒定牙髓干細胞CD44和CD34表達(×200)Fig.2 Immunohistochemical staining for expression of CD44 and CD34 in dental pulp stem cells (×200)Note:A,B.CD44 positive and negative control;C.The dental pulp stem cell marker CD44;D,E.CD33 positive control and the negative control;F.The dental pulp stem cell mark CD34.

2.3各組牙髓干細胞增殖情況比較 腎上腺髓質素+抑制劑組加入15 μmol/L的PI3K/Akt通路抑制劑LY294002，用分光光度計測定波長490 nm處的A值。培養1 d，對照組、腎上腺髓質素組和腎上腺髓質素+抑制劑組牙髓干細胞A值比較差異無統計學意義(P>0.05)；培養3 d和7 d，各組牙髓干細胞A值比較差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組比較，腎上腺髓質素組和腎上腺髓質素+抑制劑組牙髓干細胞A值升高(P<0.05)，與腎上腺髓質素組比較，腎上腺髓質素+抑制劑組牙髓干細胞A值降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組牙髓干細胞A值比較

Tab.1 Comparison of A values of dental pulp stem cells in each group

GroupsnA values1 d3 d7 dControl group70.82±0.171.58±0.181.94±0.15Adrenomedullin group70.93±0.221)2.12±0.211)2.65±0.181)Adrenomedullin +inhibitor group70.86±0.191)2)1.79±0.161)2)2.31±0.141)2)t0.57415.24135.545P0.573<0.001<0.001

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with adrenomedullin group.

2.4各組牙髓干細胞凋亡情況比較 各組牙髓干細胞凋亡率比較差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組比較，腎上腺髓質素組和腎上腺髓質素+抑制劑組牙髓干細胞凋亡率降低(P<0.05)，與腎上腺髓質素組比較，腎上腺髓質素+抑制劑組牙髓干細胞凋亡率升高(P<0.05)。見表2和圖3。

表2 各組牙髓干細胞凋亡率比較

Tab.2 Comparison of apoptotic rate of dental pulp stem cells in each group

GroupsnApoptotic rateControl group712.41±1.26Adrenomedullin group75.24±1.131)Adrenomedullin +inhibitor group77.62±1.571)2)t52.550P<0.001

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with adrenomedullin group，2)P<0.05.

圖3 流式細胞術測定各組牙髓干細胞凋亡Fig.3 Flow cytometry to determine apoptosis of dental pulp stem cells in each groupNote:PI.Propidium iodide；Annexin V FITC.Annexin V labeled with fluorescein isothiocyanate.A.Control group;B.Adrenomedullin group;C.Adrenomedullin+inhibitor group.

2.5各組細胞PCNA、Cleaved Caspase-3蛋白水平比較 PCNA可以反映細胞的增殖狀態，Cleaved Caspase-3可反映細胞凋亡情況，選擇PCNA、Cleaved Caspase-3了解細胞增殖和凋亡情況。各組牙髓干細胞PCNA、Cleaved Caspase-3蛋白水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組比較，腎上腺髓質素組和腎上腺髓質素+抑制劑組牙髓干細胞PCNA蛋白水平升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，與腎上腺髓質素組比較，腎上腺髓質素+抑制劑組牙髓干細胞PCNA蛋白水平降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。見表3和圖4。

表3 各組細胞PCNA、Cleaved Caspase-3蛋白水平比較

Tab.3 Comparison of PCNA and Cleaved Caspase-3 protein levels in each group

GroupsnPCNACleaved Caspase-3Control group70.09±0.020.28±0.06Adrenomedullin group70.33±0.051)0.12±0.031)Adrenomedullin +inhibitor group70.16±0.041)2)0.23±0.021)2)t71.08928.714P<0.001<0.001

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with adrenomedullin group，2)P<0.05.

圖4 Western blot測定各組細胞PCNA、Cleaved Caspase-3蛋白Fig.4 PCNA and Cleaved Caspase-3 proteins in each group by Western blotNote:A.Control group;B.Adrenomedullin group;C.Adrenomedullin +inhibitor group.

2.6各組細胞PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平比較 各組牙髓干細胞PI3K、p-Akt蛋白水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組比較，腎上腺髓質素組牙髓干細胞PI3K、p-Akt蛋白水平升高(P<0.05)，與腎上腺髓質素組比較，腎上腺髓質素+抑制劑組牙髓干細胞PI3K、p-Akt蛋白水平降低(P<0.05)，各組牙髓干細胞Akt蛋白水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4和圖5。

表4 各組細胞PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平比較

Tab.4 Comparison of PI3K，p-Akt，Akt protein levels in each group

GroupsnPI3Kp-AktAktControl group70.78±0.120.51±0.160.39±0.11Adrenomedullin group70.95±0.141)0.91±0.191)0.38±0.121)Adrenomedullin +inhibitor group70.36±0.091)2)0.27±0.111)2)0.41±0.091)2)t46.00729.7450.142P<0.001<0.0010.869

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with adrenomedullin group.

圖5 Western blot測定各組細胞PI3K、p-Akt、Akt蛋白Fig.5 PI3K，p-Akt，Akt proteins in each group by Western blotNote:A.Control group;B.Adrenomedullin group;C.Adrenomedullin +inhibitor group.

3 討論

齲病的發展是一系列反應，包括損傷、防御、修復三個方面，其中防御和修復在齲病的發展中具有重要作用，且具有明顯的臨床意義，因此成為齲病研究的重點。齲病的發展可侵犯牙髓組織，但臨床上保護牙髓活性的成功率比較低，因此通過分子細胞生物技術保護牙髓活性成為新的研究方向[8]。當牙髓受到損傷時，其相對部位成牙本質細胞壞死，牙髓組織中的前體細胞分化成成牙本質細胞，形成成牙本質基質，形成修復性牙本質。牙髓組織中的牙髓干細胞具有多向分化和自我更新潛能，可分化為成牙本質細胞，具有形成牙本質基質的能力，因此牙髓干細胞在牙本質再生和修復中具有重要意義[9]。

腎上腺髓質素為一種多能性肽，具有誘導成骨、調節炎癥、調節細胞遷移和凋亡等多種功能，在哺乳動物的發育中具有重要作用[10]。腎上腺髓質素可由牙本質細胞表達，在牙齒發育的關鍵時間點也有腎上腺髓質素表達，腎上腺髓質素的表達對牙本質細胞的形成和牙髓間充質干細胞有影響，腎上腺髓質素可具有促進骨形成的作用[11,12]。腎上腺髓質素也具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用[13,14]，如孫晶等[15]研究發現抑制腎上腺髓質素可抑制胃癌細胞增殖、促進胃癌細胞凋亡。本研究發現：腎上腺髓質素可升高牙髓干細胞增殖A值、降低牙髓干細胞凋亡率，升高牙髓干細胞PCNA蛋白水平，降低牙髓干細胞Cleaved Caspase-3蛋白水平。PCNA存在于腫瘤細胞和正常增殖細胞內，和細胞DNA合成有密切關系，參與細胞增殖的啟動過程，可以反映細胞的增殖狀態[16]；Caspase-3為一種蛋白酶，是細胞凋亡中最重要的終末剪切酶，是細胞凋亡的關鍵蛋白，在細胞凋亡中發揮重要作用，正常組織中Caspase-3以無活性形成存在，在凋亡途徑中最終可引起Caspase-3活化[17,18]。因此本研究結果表明腎上腺髓質素可促進牙髓干細胞增殖、抑制牙髓干細胞凋亡。

PI3K/Akt在多種細胞中廣泛存在，屬于絡氨酸激酶受體介導信號通路，參與細胞生長、增殖和分化過程[19,20]。PI3K/Akt信號通路是經典的信號傳導通路，在多種腫瘤細胞中PI3K/Akt信號通路處于激活狀態，在PI3K/Akt信號通路中，Akt位于樞紐部分，PI3K可引起Akt磷酸化而發揮生物學功能[21-23]，如張小三等[7]研究發現PI3K/Akt信號通路參與食管癌細胞的增殖和凋亡過程。本研究發現腎上腺髓質素可升高牙髓干細胞PI3K、p-Akt蛋白水平，給予PI3K/Akt信號通路抑制劑處理后，牙髓干細胞PI3K、p-Akt蛋白水平降低，且抑制腎上腺髓質素對牙髓干細胞增殖的促進作用和對牙髓干細胞凋亡的抑制作用。表明腎上腺髓質素可能通過激活PI3K/Akt通路促進牙髓干細胞增殖、抑制牙髓干細胞凋亡。

綜上所述，腎上腺髓質素可促進牙髓干細胞增殖、抑制牙髓干細胞凋亡，其機制可能與其激活PI3K/Akt信號通路有關。