丙泊酚對小鼠小腦神經細胞及Jagged1、Notch1蛋白表達的影響

王根生 盧錫華 李廷坤 楊青存

(鄭州大學附屬腫瘤醫院麻醉科，鄭州 450003)

麻醉藥物損傷嬰幼兒學習記憶功能一直是大眾關注的熱點。文獻報道，全麻后可能2歲以下嬰幼兒造成較長時間的人格及行為變化，這說明全麻藥能給嬰幼兒中樞神經帶來損害[1]。丙泊酚的特點是術后惡心嘔吐發生率低、起效快、恢復快、作用時間短，作為一種新型的全身麻醉藥被廣泛運用于麻醉的誘導、維持及鎮靜。但是，目前仍未清楚丙泊酚對神經系統損傷機制。

在腦部發育中小腦能夠調控其他區域功能形成，兩者間有著復雜的聯系。許多研究指出，小腦參與情感、認知等高級功能[2,3]，而發生功能障礙時可能導致自閉癥、朱比特綜合征、唐氏綜合征及其他精神疾病產生[4]。長期以來，研究報道指出丙泊酚可能引起運動障礙[5]，這說明丙泊酚能作用于小腦并造成損傷。還有報道指出丙泊酚對小腦組織中重要細胞-蒲肯野細胞活動產生抑制作用[6]，同時對小腦神經環路也造成影響[7,8]。本研究采用Western blot和免疫熒光組織化學檢測丙泊酚對新生小鼠小腦神經損傷情況，探討其對小腦神經損傷作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 HE染色劑(北京中杉公司)；熒光二抗、生物素化二抗(Invitrogen 公司)；丙泊酚(AstraZenenca 公司，批號:KV697);BCA試劑盒劑(碧云天公司)；SABC 試劑盒(Vector 公司)；Jagged1、Notch1抗體(BD公司)；10%脂肪乳(安徽豐原藥業股份有限公司);DAB 顯色試劑盒(北京中杉公司)。

1.1.2儀器 超低溫冰箱(Thermo scientific)；低溫高速離心機(Thermo公司)；冰凍切片機(Leica CM1950 型)；蛋白電泳儀(Bio-Rad)；照相儀器(ZEISS AX10 型)；Western曝光儀(Bio-Rad)。

1.2方法

1.2.1實驗動物與分組 健康臨產孕鼠(體質量24～32 g)由鄭州大學實驗動物中心提供，4月齡。維持動物房22～26℃飼養，自然采光，保證飲水及食物。小鼠剛出生時記為P0，每24 h依次記為P1、P2等。P7 時，隨機將新出生小鼠分為三組：對照組(Control group)、30 mg/kg丙泊酚組(Pro 30 mg/kg group)、60 mg/kg丙泊酚組(Pro 60 mg/kg group)[9]，每組各5只。

1.2.2模型建立 P7 時，對照組、低劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組分別腹腔注射10%脂肪乳溶劑、丙泊酚30 mg/kg、60 mg/kg。24 h后處死小鼠，收取標本作熒光免疫組化(圖片分析均選擇小腦葉片相同區域)及Western blot試驗。

1.2.3HE染色 將取出的小腦組織經4%多聚甲醛溶液固定，包埋，連續切片，厚度約3 μm，行 HE 染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.2.4免疫組織化學熒光染色 小鼠處死后，取腦標本置于 4%多聚甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規脫蠟、水化，置于修復液中微波加熱修復，H2O2封閉，PBS 漂洗后 0.3% Triton 37℃ 處理30 min，3%胎牛血清(BSA)封閉反應30 min，滴加適量稀釋的大鼠CB、BLBP、GFAP抗體，4℃孵育過夜，PBS 沖洗8 min×3次，將標本置于免疫熒光二抗中，37℃孵育2 h，PBS 漂洗8 min×3次，DAPI 進行復染，再次 PBS 漂洗后漂片，晾干，熒光封片劑封片。

1.2.5Western blot檢測 小鼠處死后，迅速取小腦新鮮組織，采用RIPA 裂解法提取總蛋白，并用 BCA 法測定蛋白濃度并調至一致。將蛋白樣品和加樣緩沖液混合煮沸變性，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳條件：濃縮膠恒壓60 V 約 30 min，分離膠120 V 約90 min。轉至 PVDF 膜，2.5%脫脂奶粉封閉2 h，加適量一抗Jagged1、Notch1在4℃孵育過夜后，加入二抗室溫振蕩孵育2 h，經ECL顯色后膠片曝光顯影，并用Image J軟件對條帶進行分析。用 Quantity One軟件對蛋白質條帶進行分析，測定其吸光度(A)值。以A目的蛋白/AGAPDH表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1小腦HE染色 選取新生小鼠小腦葉片同一部位顯微觀察，對照組、30 mg/kg丙泊酚組、60 mg/kg丙泊酚組間外顆粒層(EGL)厚度比較差異無統計學意義(P>0.05，n=5)，見圖1。

2.2免疫熒光檢測 與對照組相比，低劑量丙泊酚組蒲肯野細胞數量差異無統計學意義(P>0.05)，而高劑量丙泊酚組蒲肯野細胞數量較對照明顯減少(P<0.05，n=5)，見圖2。

2.3BLBP、GFAP熒光染色結果 與對照組相比，低劑量及高劑量丙泊酚組BLBP陽性纖維數量減少(P<0.05，n=5)；與對照組相比，低劑量組GFAP陽性纖維數量差異無統計學意義(P>0.05)，而高劑量丙泊酚組GFAP陽性纖維數量較對照組顯著減少(P<0.05，n=5)；與對照組相比，丙泊酚高劑量小腦內顆粒層及深部白質區域GFAP陽性纖維光密度值明顯上升(P<0.05，n=5)，這說明有星形膠質細胞增生，見圖3。

2.4Western blot檢測結果 與對照組相比，丙泊酚低劑量組中Jagged1、Notch蛋白表達水平均明顯下降(P<0.01,P<0.05)，并且丙泊酚高劑量組中Jagged1、Notch蛋白表達水平較對照組進一步降低(P<0.01,P<0.01)。丙泊酚低劑量和高劑量組中Jagged1蛋白較對照組分別下調23%和32%，而Notch蛋白則分別下調25%和37%，見圖4。

圖1 新生小鼠小腦HE染色結果(×400)

Fig.1 HE staining of cerebellum in neonatal mice(×400)

Note: A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D.Comparison of outer granule thickness among three groups.

圖2 新生小鼠小腦浦肯野細胞染色(×400)

Fig.2 Purkinje cell staining of cerebellum in neonatal mice(×400)

Note: A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D.Number of Purkinje cells,*.P<0.05 vs Control.

3 討論

丙泊酚是目前臨床上的新型麻醉藥，具有起效快、功能恢復快且蘇醒迅速的特點，主要用于麻醉誘導、維持及 ICU 鎮靜。研究報道10 min內丙泊酚對嬰幼兒劑量分別為25 mg/(kg·h)(<3月)，20 mg/(kg·h)(3～6月)，15 mg/(kg·h)(6～12月)，12 mg/(kg·h)(1～3歲)。研究還發現，新生兒時期如接觸麻醉制劑，則可能導致新生兒長期認知改變及大腦受損[10，11]，同時有臨床研究報道，新生兒時期麻醉會影響兒童后期學習能力[12]，并且可能是造成行為障礙及腦發育損傷的高危因素[13]。小腦皮層是由顆粒細胞層、浦肯野細胞層及分子層構成，主要包括高爾基細胞、顆粒細胞、浦肯野細胞等，其中顆粒細胞是以谷氨酸為遞質的興奮性神經元，其余高爾基細胞、浦肯野細胞等均是以 GABA 作為遞質的抑制性神經元。蒲肯野細胞位于小腦蒲肯野細胞層，是特殊的大細胞神經元。出生后2周內，是蒲肯野細胞發育的主要時期，其細胞結構改變形成多分支狀樹突生長[14]。在小腦環路中，經蒲肯野細胞整合后發出的信息參與動作學習和動作協調，屬于唯一的傳出神經元[15，16]。國內外文獻報道，新生期注射丙泊酚會導致出生后典型板層結構發生變化，以及海馬區細胞丟失[17]。本實驗表明，丙泊酚注射后會明顯抑制新生小鼠小腦蒲肯野細胞數量(P<0.05)，且抑制程度與劑量相關，這說明小腦可能是丙泊酚的作用靶點，且丙泊酚具有神經毒性作用;伯格曼膠質細胞(Bergman glial cell)為神經膠質細胞的一種，在小腦皮質發育過程中會發出放射狀纖維至外顆粒層表面，這種放射狀細胞又會分化形成伯格曼細胞[18]。作為Bergman膠質細胞的特異性標記物，GFAP可以同時標記放膠樣及星膠樣Bergman細胞，而BLBP可以標記放射狀膠質細胞。本實驗結果顯示，丙泊酚麻醉小鼠后，Pro 30 mg/kg組及Pro 60 mg/kg組BLBP陽性纖維數量均較對照組明顯減少(P<0.05)；GFAP染色觀察結果顯示，Pro 30 mg/kg組中GFAP陽性纖維數量較對照組無明顯差異，而Pro 60 mg/kg處理后，GFAP膠質纖維數量較對照組明顯減少(P<0.05)。同時，Pro 60 mg/kg組內顆粒層和白質中BFAP陽性染色光密度值較對照組明顯上升(P<0.05)，這說明丙泊酚可能促進了放膠樣到星膠樣細胞的轉化，從而對伯格曼膠質細胞造成影響。

圖3 BLBP、GFAP熒光染色(×400)

Fig.3 Fluorescence staining results of BLBP and GFAP(×400)

Note: A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D,E and F represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;G.GFAP positive fiber number (scale length 100 μm);H.BLBP positive fiber number (scale length 100 μm);I.GFAP positive staining light density value,*.P<0.05 vs Control group；#.P<0.05 vs Control group.

圖4 Western blot檢測新生小鼠小腦中Jagged1、Notch 蛋白表達Fig.4 Detection of Jagged1 and Notch protein expression in cerebellum of neonatal mice by Western blotNote:A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D.Relative expression level of Jagged1 and Notch protein,*.P<0.01 vs Control group；#.P<0.05 vs Control group.

研究報道，Notch 信號通路是Bergman膠質細胞分化、成熟的相關重要信號通路之一。研究發現，出生后2周內小腦在發育過程中Bergman膠質細胞出現Notch及其配體 Jagged 蛋白表達[19]。此外，小腦中Notch信號通路被激活后還能促進星形細胞向放射狀膠質細胞的轉化[20]。許多研究表明，小鼠敲除Notch或者Jagged基因后，小腦中伯格曼膠質細胞不僅數量減少并且發育異常，進而導致蒲肯野細胞發育障礙以及顆粒神經元遷移受阻[21]。本研究中Western blot檢測結果顯示，在丙泊酚低劑量、高劑量處理后Notch 及 Jagged 蛋白表達水平顯著下調，提示Notch 信號通路異常與Bergman膠質細胞的損傷、表型失衡和轉化相關，而這也可能是丙泊酚引起小腦發育異常的源頭。

綜上所述，丙泊酚麻醉可明顯抑制浦肯野細胞數量、Bergman膠質細胞的發育及纖維形成，同時對小腦中Jagged1、Notch 蛋白表達也產生抑制作用。通過本實驗可以看出，小腦作為參與高級認知功能并與大腦有復雜聯系的神經組織易受到丙泊酚的神經毒性作用，提示應用丙泊酚要注意對新生兒小腦的影響，也為其治療提供新的思路及研究方向。