STAT3誘捕寡核苷酸經STAT3/IRF-1通路抑制腫瘤細胞PD-L1的表達①

依 含 黃建勝 李 雪 朱乃碩

(復旦大學生命科學學院,上海 200438)

近年來，腫瘤發病率逐年上升，已成為一類嚴重危害公眾健康的疾病。與傳統的腫瘤治療手段相比，免疫療法更具有特異性，毒副作用更小。因此針對免疫檢查點(Immune checkpoint)的調節或阻斷劑在腫瘤免疫治療中的應用受到學界的高度重視，其中程序性細胞死亡蛋白1(Programmed cell death-1，PD-1，CD279)與CTLA-4(CD152)的發現被授予2018年諾貝爾生理學和醫學獎。1992年，免疫檢查點PD-1首次被發現[1]，與其配體PD-L1 (B7-H1或CD274)為一對重要的介導免疫耐受的分子[2,3]。PD-L1可表達在抗原遞呈細胞或腫瘤細胞表面，可與活化的T細胞、B細胞表面的PD-1結合，抑制免疫應答，促進腫瘤細胞免疫逃逸[4,5]，PD-1/PD-L1引起的免疫抑制機制包括促使T細胞凋亡、失活或者耗竭，上調IL-10的表達等[6-9]；目前，抗PD-1/PD-L1單克隆抗體藥物，如Nivolumab、Keytruda、Pembrolizumab和Avelumab等已在抗腫瘤治療效果上取得重大突破[6,10-12]。然而，PD-L1不僅表達在腫瘤細胞表面，也表達在樹突狀細胞、巨噬細胞和間充質干細胞等細胞表面[13,14]，單克隆抗體對PD-1或PD-L1非選擇性的阻斷作用可能會引起機體免疫系統功能紊亂、自身免疫疾病，同時抗體作為異源性生物大分子，長期用藥則會引發機體產生抗體，引起藥物耐受，使得抗體藥物的長效性受限。目前抗體藥物價格昂貴，普通患者及其家庭也難以承受。因此，研發新型的、更加安全有效的小分子藥物依然十分必要。

誘捕寡核苷酸(Decoy oligonucleotide,Decoy-ON)[15]是一類20 bp以下的短鏈DNA或RNA，可以高特異性、高親和性地結合目標蛋白、多肽或胞內大分子，通常以內吞途徑快速進入細胞，免疫原性小，成本低，是理想的靶向性藥物材料。

人源STAT3 Decoy-ON是15 bp的雙鏈DNA，序列為CATTTCCCGTAAATC。其5′端與3′端分別有三個核苷酸經硫代磷酸酯修飾，通過內吞途徑進入細胞后高效地結合pSTAT3(KD=122 nmol/L)，并且抑制pSTAT3激活其下游基因表達[16,17]。STAT3屬于信號轉導和轉錄激活因子(Signal transducer and activator of transcription，STAT)蛋白家族，該蛋白家族是一類調節細胞增殖、存活和分化的轉錄因子，STAT3是致癌信號傳導的關鍵介質[18]，被認為是癌基因，可以激活下游IRF-1、cyclin D1、IL-10、survivin等基因的表達[19-21]。在大量人類癌癥組織中可以檢測到STAT3被激活，體外研究表明抑制STAT3的表達會降低多種癌細胞系的增殖和存活能力[22,23]，而正常細胞中STAT3處于未激活狀態，因此它被認為是更具特異性且更安全的抗腫瘤治療靶點。此外，STAT3能夠調控樹突狀細胞(DCs)、人多能間充質基質細胞(hMSCs)中PD-L1的表達[14,24-26]。STAT3 Decoy-ON靶向作用于pSTAT3后，可阻斷pSTAT3與下游基因啟動子上的識別位點結合，抑制cyclin D1、Bcl-xL等腫瘤相關基因的活化，并增強癌細胞對化療藥物的敏感性[16,27]，且免疫原性小，無明顯毒副作用。以往研究提示，STAT3 Decoy-ON可能是一種具有潛力的抗腫瘤小分子藥物，而在腫瘤細胞中，其是否能夠通過靶向pSTAT3而行使對PD-L1的調控鮮有報道。本研究以前列腺癌細胞DU145為模型，對STAT3及其下游相關因子IRF-1對腫瘤細胞PD-L1的表達影響進行了研究，證明STAT3 Decoy-ON對DU145細胞中免疫調控分子PD-L1的表達具有顯著抑制作用，并初步明確其作用機制，進一步揭示了STAT3 Decoy-ON的抗腫瘤功能。

1 材料與方法

1.1材料 人前列腺癌細胞DU145購自ATCC網站，細胞基礎培養基DMEM，×100青鏈霉素合劑、2.5%EDTA胰酶(Gibco公司)，TRIzon無酶分離液(Life公司)，PBS、胎牛血清(維森特公司)，10×電轉緩沖液、20×TBS、SDS-PAGE凝膠試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司)，PD-L1-FITC熒光抗體(Biolegend公司)，RIPA(Beyotime公司)，抗STAT3抗體、抗PD-L1抗體、抗IRF-1抗體(Abcam公司)，抗GAPDH抗體、兔抗鼠HRP抗體、5×SDS蛋白上樣緩沖液(Beyotime公司)，cDNA反轉錄試劑盒、SYBN熒光定量試劑盒(Roche公司)，ECL顯色試劑盒(ThermoFisher公司)，Dual-Luciferase Reporter Assay System(Prome-ga公司)，以上試劑均為商品化產品。STAT3誘捕寡核苷酸由鉑尚生物技術有限公司合成。其他常用試劑為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1細胞培養 DU145細胞使用添加10%胎牛血清、100 μl/ml雙抗的DMEM培養基，在37℃、5% CO2的恒溫箱中進行培養，細胞密度約為80%～90%時，以2.5%EDTA的胰酶進行細胞消化，按照1∶(2～3)的比例進行傳代。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞表面STAT3 Decoy-ON或PD-L1陽性率 6孔板內準備每孔1×106個腫瘤細胞，與200 nmol/L FAM標記的STAT3 Decoy-ON(PBS稀釋)在37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中孵育2 h，以僅加PBS組細胞為空白對照組，無酶分離液消化細胞5 min，1 500 r/min離心2 min收集細胞，棄去上清細胞培養基，并用PBS充分洗滌細胞，再次離心收集細胞，用PBS制成400 μl細胞懸液，流式細胞儀上機檢測波長為488 nm激發光通道的熒光強度。準備每孔1×106個腫瘤細胞，與500 nmol/L的STAT3 Decoy-ON在37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中孵育48 h，按照上述步驟收集并洗滌細胞，100 μl PBS重懸細胞，加入1 μl PD-L1流式熒光抗體，室溫下避光孵育20 min，PBS洗滌3次，制成400 μl 細胞懸液，流式細胞儀上機檢測波長為488 nm激發光通道的熒光強度。

1.2.3細胞免疫熒光 將蓋玻片在無菌PBS中浸泡洗滌，放入75%酒精中浸泡24 h，無菌環境下晾干玻璃片，放入12孔細胞培養板，鋪入每孔1×105個腫瘤細胞進行貼壁培養，加入500 nmol/L FAM標記的STAT3 Decoy-ON，避光在37℃、5% CO2的恒溫培養箱中孵育2 h，避免晃動細胞培養板使蓋玻片移位。在避光環境下，棄去細胞培養上清液，用PBS輕柔沖洗細胞，加入4%多聚甲醛室溫下固定細胞10 min，PBS洗滌細胞后加入10 μl DAPI(1∶1 000稀釋)，避光染核20 min，PBS充分洗滌細胞，將蓋玻片移動到載玻片上進行封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下進行鏡檢，以紫外光定位DAPI的藍色熒光，以藍光觀察FAM的綠色熒光。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 無酶分離液消化并收集500 nmol/L STAT3 Decoy-ON干預后腫瘤細胞，加入200 μl RIPA在冰上裂解細胞抽提蛋白質并定量。蛋白經10% SDS-PAGE電泳后，180 V、35 min電轉至PVDF膜。將PVDF膜置于搖床上，室溫下在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉2 h，根據說明書比例稀釋STAT3、PD-L1、IRF-1或內參GAPDH一抗，4℃冰箱孵育過夜，按照說明書比例稀釋HRP二抗，室溫下孵育1 h，避光環境下在PVDF膜上滴加ECL顯色試劑并立即曝光。曝光后的條帶應用Image J軟件進行灰度值分析，結果應用GraphPad Prism5軟件進行繪圖。

1.2.5qRT-PCR檢測目的基因mRNA 收集500 nmol/L STAT3 Decoy-ON干預后的腫瘤細胞，利用TRIzon法抽提細胞總RNA，測定RNA濃度，并立即用Roche反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，-80℃保存待用。應用Roche公司SYBN熒光定量試劑盒進行相關基因的定量分析，反應條件為：變性95℃ 3 min，擴增95℃ 10 s、57℃ 20 s、72℃ 30 s、40個循環，溶解曲線測定95℃ 15 s、60℃ 15 s、梯度升溫到100℃。以β-actin的Ct值為內參計算目的基因Ct值的2-ΔΔCt，得到目的基因的相對表達量，結果應用GraphPad Prism5軟件進行繪圖。qPCR使用引物見表1。

1.2.6PD-L1啟動子突變熒光素酶質粒的構建與轉染 將PD-L1起始密碼子ATG上游的啟動子序列(-599 bp至0 bp)克隆至螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferases)質粒pGL4.18 [luc2P/Neo]熒光素酶基因的上游。應用單引物循環PCR技術和環狀質粒PCR技術將PD-L1啟動子上STAT3與IRF-1識別位點進行突變或缺失改造[28]。以海腎熒光素酶(Renilla luciferases)質粒pGL4.74[hRluc/TK]的熒光強度作為實驗內參。將DU145細胞鋪入96孔板，應用Lipo3000脂質體轉染試劑將100 ng重組pGL4.18質粒與5 ng pGL4.74質粒共轉染進腫瘤細胞，空白pGL4.18質粒作為陰性對照。36 h后，吸去培養基，PBS洗滌1次，應用Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒檢測細胞中兩種熒光素酶的熒光強度：每孔細胞加入20 μl PLB溶液，再加入100 μl LARⅡ，延遲10 s后上機檢測Firefly熒光強度，加入100 μl Stop & Glo Reagent，檢測內參Renilla熒光強度，計算每孔細胞Firefly與Renilla熒光強度比值，得到相對熒光活性(RLAs)，結果應用GraphPad Prism5軟件進行繪圖。

2 結果

2.1STAT3誘捕寡核苷酸對DU145細胞的親和性探究 將FAM熒光標記的STAT3 Decoy-ON與DU145細胞孵育2 h，流式細胞儀檢測細胞表面STAT3 Decoy-ON的陽性率(圖1)，圖中紅色曲線表示STAT3 Decoy-ON實驗組細胞群，黑色曲線為空白對照組細胞群，結果顯示DU145細胞表面STAT3 Decoy-ON陽性率為(50.93±4.47)%，表明STAT3 Decoy-ON可以有效吸附在DU145細胞表面。將STAT3 Decoy-ON-FAM與DU145細胞孵育2 h后激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，DAPI定位細胞核(藍色熒光)，DU145細胞質中存在大量的STAT3 Decoy-ON-FAM(綠色熒光)(圖2)，說明STAT3 Decoy-ON能夠有效親和并進入DU145細胞。

圖1 流式細胞儀檢測STAT3 Decoy-ON與DU145細胞親和性Fig.1 Affinity of STAT3 Decoy-ON with DU145 detected by Flow cytometryNote:The STAT3 Decoy-ON-FAM was detected in the FL1 channel.***.P<0.001 vs Blank control.

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測STAT3 Decoy-ON與DU145細胞親和性(×100)Fig.2 Affinity of STAT3 Decoy-ON with DU145 detected by laser scanning confocal microscopy (×100)

表1 qRT-PCR檢測引物

Tab.1 Primers of qRT-PCR

GeneForward(5′→3′)Reverse(5′→3′)STAT3GGAGCAGAGATGTGGGAATGCTTGGTGGTGGAGGAGAACTPD-L1GTGGCATCCAAGATACAAACTCTCCTTCCTCTTGTCACGCTCAIRF-1GTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCTACGGTGCACAGGGAATGGCCTGβ-actinAGCAAGCAGGAGTATGACGGTGGGGTGGCTTTTAGGA

2.2STAT3誘捕寡核苷酸對DU145細胞STAT3的調控 將DU145細胞與STAT3 Decoy-ON進行孵育，分別收集干預24 h、36 h、48 h與72 h 后的細胞，檢測STAT3在不同時間段的mRNA與蛋白質的表達量。相對于對照組細胞，實驗組細胞干預24 h后STAT3 mRNA水平下調10.0%，36 h下調28.1%，48 h下調33.3%，72 h 下調8.0%(圖3A)，36 h與48 h下調作用最顯著(P<0.001)。蛋白質Western blot檢測結果經Image J軟件計算條帶相對灰度，36 h與48 h時STAT3 Decoy-ON對STAT3蛋白表達的抑制性顯著(P<0.05)，分別下調表達33%與21%(圖3B、C)。說明STAT3 Decoy-ON可以下調STAT3本身的表達。

圖3 STAT3 Decoy-ON干預后DU145細胞STAT3的表達情況Fig.3 Result of STAT3 expression in DU145 after STAT3 Decoy-ON administrationNote:A.STAT3 mRNA qRT-PCR analysis.B.STAT3 protein Western blot analysis；C.Relative band grey value of Western blot.*.P<0.05 **.P<0.01，***.P<0.001 vs Blank control.

2.3STAT3誘捕寡核苷酸對DU145細胞PD-L1的表達調控 以500 nmol/L STAT3 Decoy-ON干預DU145細胞48 h，無酶分離液消化并收集細胞，孵育PD-L1-FITC熒光抗體，流式細胞儀檢測細胞表面PD-L1的陽性率，圖4中紅色曲線表示寡核苷酸實驗組PD-L1陽性細胞群體，黑色曲線表示空白對照組PD-L1陽性細胞群體，結果顯示，DU145細胞表面PD-L1陽性率下降11.3%，相對于空白對照組PD-L1下調44.5%(P<0.001)。說明經過STAT3 Decoy-ON干預后，DU145細胞表面的PD-L1表達量可以被顯著下調。

圖4 流式細胞儀檢測STAT3 Decoy-ON干預后DU145細胞表面PD-L1表達情況Fig.4 Flow cytometry analysis of PD-L1 expression on DU145 after STAT3 Decoy-ON administrationNote:The FITC was detected in the FL1 channel.***.P<0.001 vs Blank control.

用500 nmol/L的STAT3 Decoy-ON與DU145分別孵育24 h、36 h、48 h和72 h，檢測干預后的PD-L1 mRNA轉錄量。結果表明(圖5A)24 h后，STAT3 Decoy-ON顯著下調DU145細胞PD-L1的轉錄(P<0.05)，直到干預后的72 h 下調作用依舊顯著。4個時間段相對于對照組，STAT3 Decoy-ON組PD-L1的mRNA表達量分別下調9.2%、61.7%、62.1%與64.6%，其中36 h、48 h與72 h 下調作用最為顯著(P<0.001)。細胞經干預后進行Western blot分析(圖5B、C)，結果經Image J軟件進行條帶相對灰度值計算，4個時間段PD-L1蛋白表達分別下調16.1%(P<0.05)、64.3%(P<0.001)、71.1%(P<0.001)與75.0%(P<0.001)。證明STAT3 Decoy-ON可顯著抑制DU145細胞中PD-L1的表達。

表2 位點突變質粒

Tab.2 Plasmids of sites mutation

PlasmidMutation siteBanding site sequence(5′to 3′)Mutation sequence(5′to 3′)pGL599---pGL383STAT3x--599 bp to -384 bppGL252STAT3x--599 bp to -253 bppGL222STAT3x/a--599 bp to -223 bppGL131STAT3x/a;IRF-1α/β--599 bp to -132 bppGL599-mIRF1αIRF-1αTTTCACTTTCTGTTTCATTTCTGTAACCTTCTGTTTCATTTCpGL599-mIRF1βIRF-1βATACCTAAACTGAAAGCTTCCATACCTAAGCTTACAGCTTCCpGL599-DmIRF1IRF-1α/βTGTTTCACTTTCTGTTTCATTTCTAAACTGAAAGCTTCCTGTGTAACCTTCTGTTTCATTTCTAAGCTTACAGCTTCCpGL599-mSTATaSTAT3aTTTACAAGAAATCGACAACTCApGL252-mSTATaSTAT3aTTTACAAGAAATCGACAACTCApGL599-mSTATxSTAT3xTTTATCAGAAAGGGGGACGCCTTTCTGATAAATAGATCACTCAGGGGGACGCCTAGCTGATGCA

圖5 STAT3 Decoy-ON干預后DU145細胞PD-L1的表達情況Fig.5 Result of PD-L1 expression in DU145 after STAT3 Decoy-ON administrationNote:A.PD-L1 mRNA qRT-PCR analysis；B.PD-L1 protein Western blot analysis；C.Relative grey value of Western blot.*.P<0.05 or ***.P<0.001 vs Blank control.

2.4STAT Decoy-ON調控PD-L1表達的機制探究 干擾素調節因子1(Interferon regulatory factor-1,IRF-1)與PD-L1的表達密切相關。以JASPAR軟件(85%閾值)預測PD-L1轉錄起始位點上游1 000 bp范圍內STAT3和IRF-1識別位點(圖6)，在-208 bp至-188 bp、-151 bp至-131 bp處分別存在兩個IRF-1識別位點，將-208 bp至-188 bp位點稱為IRF1α位點，將-151 bp至-131 bp位點稱為IRF1β。在-415 bp至-405 bp、-394 bp至-384 bp、-233 bp至-223 bp處分別存在三個STAT3識別位點，將-233 bp至-223 bp位點稱為STAT3a，-415 bp至-405 bp與-394 bp至-384 bp兩個位點稱為STAT3x。將PD-L1啟動子序列(-599 bp至0 bp)克隆至Firefly熒光素酶質粒pGL4.18中，并分別構建STAT3a、STAT3x、IRF1α和IRF1β識別位點突變或截短的PD-L1啟動子熒光素酶質粒(表2)，利用雙熒光素酶報告系統分析STAT3和IRF-1對PD-L1的表達調控作用。

由圖7A可見，IRF1α和IRF1β單識別位點突變(pGL599-mIRF1α和pGL599-mIRF1β)時， PD-L1啟動子活性分別下調37.6%與29.7%(P<0.01與P<0.05)；當IRF-1雙識別位點突變(pGL599-DmIRF1)時，PD-L1啟動子活性下降80.9%(P<0.001)。該結果說明IRF-1是PD-L1表達的關鍵轉錄因子，其識別位點的突變顯著抑制PD-L1的轉錄活性。

圖6 PD-L1啟動子STAT3、IRF-1結合位點預測Fig.6 Prediction of STAT3,IRF-1 binding site on PD-L1 promoter

STAT3x位點突變(pGL559-mSTAT3x、pGL383或pGL252)分別顯著下調PD-L1啟動子活性達41.5%、48.6%與41.9%(P<0.01、P<0.001與P<0.01)(圖7B)。STAT3a位點突變(pGL599-mSTAT3a)顯著下調啟動子活性51.0%(P<0.001)。STAT3a/x識別位點同時突變(pGL252-mSTAT3a或pGL222)分別下調啟動子活性41.5%與63.1%(P<0.01與P<0.001)。證明STAT3x或STAT3a識別位點的缺失或突變皆可顯著下調PD-L1啟動子活性。STAT3與IRF-1識別位點全部突變(pGL131)下調啟動子活性達70.6%(P<0.001)。由以上結果可推論，阻斷STAT3結合其PD-L1啟動子上的識別位點可以直接抑制PD-L1的表達，同時也證實IRF-1對PD-L1的表達有著重要的調控作用。

圖7 STAT3與IRF-1結合位點突變或缺失PD-L1啟動子的活性Fig.7 Activity of PD-L1 promoter with mutation or deficiency of STAT3 and IRF-1 binding sitesNote:A.PD-L1 promotor activity with mutation or deficiency of IRF-1 binding site；B.PD-L1 promotor activity with mutation or deficiency of STAT3x and STAT3a binding site.*.P<0.05,**.P<0.01 or ***.P<0.001 vs pGL599.

將STAT3 Decoy-ON與DU145細胞孵育48 h后，檢測IRF-1的表達情況。通過qRT-PCR檢測發現(圖8A)IRF-1的mRNA表達量顯著下調59.5%(P<0.001)，同時，通過Western blot檢測發現(圖8B)IRF-1的蛋白質表達量有明顯下降。說明STAT3Decoy-ON可調控DU145細胞中IRF-1的表達。由此證明，在DU145細胞內STAT3 Decoy-ON可能通過對STAT3的下調或阻斷直接抑制PD-L1的表達，同時，還可以介導IRF-1的信號通路對PD-L1進行調控(圖9)。

圖8 STAT3 Decoy-ON干預后DU145細胞IRF-1的表達情況Fig.8 Result of IRF-1 expression after STAT3 Decoy-ON ad ministrationNote:A.IRF-1 mRNA qRT-PCR analysis，***.P<0.001 vs Blank control；B.IRF-1 protein Western blot analysis.

圖9 STAT3 Decoy-ON調控前列腺癌細胞(DU145)中PD-L1表達的機制模式圖Fig.9 Proposed regulatory mechanism of PD-L1 expression with the STAT3 Decoy-ON in Prostate cancer (DU145) cells

3 討論

免疫逃逸是腫瘤治療的一大難點，PD-1/PD-L1是腫瘤免疫耐受形成的關鍵分子，現已證實PD-L1可在多種實體腫瘤中過度表達并幫助腫瘤進行免疫逃逸，如頭頸部鱗癌、乳腺瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤等[4,29-31]，因此，PD-1/PD-L1免疫檢查點阻斷劑在腫瘤免疫治療方面被寄予厚望；美國食品和藥物管理局(FDA)已經批準了多種抗PD-1/PD-L1抗體藥物，然而單克隆抗體對PD-1/PD-L1無差別的阻斷很可能會打破機體自身免疫平衡引發免疫系統疾病[3]。正因如此，開發一種更安全的PD-L1靶向抑制藥物是十分必要的。Decoy-ON作為短鏈的DNA或RNA，開發為小分子藥物具有以下幾個優勢：①可與目標蛋白質高度特異性結合；②分子量小，更易突破組織屏障到達病灶處；③免疫原性小，不刺激機體產生抗體，無明顯毒副作用；④易于合成與制備，且生產成本低廉。其中STAT3 Decoy-ON與pSTAT3可以高效親和，抑制pSTAT3激活下游癌基因的表達，發揮一定的抗腫瘤功效，是一個極具開發潛力的新型抗腫瘤小分子藥物。

本研究中發現STAT3 Decoy-ON可以有效地進入前列腺癌細胞DU145，顯著下調DU145細胞STAT3癌基因的表達，在干預36 h與48 h下調作用最顯著。經STAT3 Decoy-ON干預后，DU145細胞表面的PD-L1顯著下調，給藥后24 h、36 h、48 h與72 h 均可顯著抑制DU145細胞中PD-L1的表達，結合寡核苷酸藥物本身優勢，提示STAT3 Decoy-ON可能具有被開發為針對PD-L1免疫檢查點抗腫瘤藥物的潛力。而STAT3 Decoy-ON作為寡核苷酸小分子，如何使其功能更具長效性，其在動物模型中能否有效抑制PD-L1的表達有待繼續研究，可下一步的討論。

IRF-1是一個重要的多功能轉錄因子，在肺癌、黑色素瘤等細胞中IRF-1與 PD-L1的高表達密切相關[32,33]，后續研究證實在多種腫瘤細胞中interferon gamma-JAK1/JAK2-STAT1/STAT2/STAT3-IRF1是調控PD-L1表達的重要信號通路之一[34,35]。本研究構建了PD-L1啟動子上STAT3與IRF-1識別位點缺失或突變的熒光素酶報告質粒，發現STAT3識別位點缺失或突變時，PD-L1啟動子活性顯著下調，提示STAT3 Decoy-ON可能通過阻斷pSTAT3結合PD-L1啟動子上的識別位點直接下調PD-L1的表達。當IRF-1識別位點缺失或突變時皆顯著下調PD-L1啟動子活性；以STAT3 Decoy-ON干預細胞后，發現IRF-1的表達量被顯著下調，證實IRF-1是前列腺癌細胞株中STAT3下游影響PD-L1表達的關鍵轉錄因子，證明了STAT3 Decoy-ON介導STAT3與IRF-1協同調控DU145細胞中PD-L1的表達，進一步揭示了STAT3 Decoy-ON抗腫瘤的功能與機制。

STAT3 Decoy-ON作為一種新的研究方向與技術路線，盡管仍有許多問題尚待探究，但其作為小分子候選藥物的優勢不容忽視，在治療實體腫瘤方面可能具有很大的潛力。