miR-206靶向調控活化的T細胞核因子對人前列腺癌細胞增殖和侵襲的影響①

崔 崎 韓 玲 郭小鵬

(新疆醫科大學附屬中醫醫院泌尿科，烏魯木齊 830000)

前列腺癌是西方國家發病率和死亡率較高的男性惡性腫瘤，近些年來，隨著工作壓力的增加，前列腺癌的發病率逐年升高[1]。目前臨床上前列腺癌主要的治療方式是外科手術，但對于轉移性前列腺癌主要方法是保守治療，預后較差，因此需要尋找一些轉移分子標志物，改善預后[2]。MircoRNA可通過多種方式調節腫瘤細胞的增殖與轉移，發揮致癌基因或抑癌基因的作用。MircoRNA-206(miR-206)是MircoRNA家族成員之一，有學者發現其可抑制結直腸癌細胞增殖，抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲能力[3，4]。目前關于miR-206在前列腺癌中的作用報道較少，因此本研究主要探討miR-206在前列腺癌中的表達水平及其對增殖與侵襲的影響，并初步研究其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 PC-3細胞和RWPE-1細胞購自中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑和儀器 Trizol試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Gibco胎牛血清購自上海素爾生物科技有限公司；RPMI1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司；DMSO、蛋白雙染marker、顯影液、5%脫脂奶粉、NFAT5、PCNA、Vimentin、E-cadherin、GADPH單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG二抗購自上海生工公司；雙熒光素酶檢測報告系統試劑盒購自Promega公司；TransScript Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)購自北京全式金生物技術有限公司；2× SYBR Green qPCR Master Mix購自北京冬歌博業生物科技有限公司；日本同仁CCK8試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室購自上海子起生物科技有限公司；前列腺癌細胞株PC-3購自上海奧陸生物科技有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)含酚紅購自金克隆(北京)生物技術有限公司；脂質體LipofectamineTM2000 Transfection Reagent購自上海廣銳生物科技有限公司；miR-206模擬物(mimics)及無關序列對照購自上海吉瑪公司；pultton超微量分光光度計購自北京五洲東方科技發展有限公司，實時熒光定量PCR儀購自云南臨康生物科技有限公司；Thermofisher梯度PCR儀購自上海恒斐生物科技有限公司；德國CO2培養箱WCI-180購自蘇州貝銳儀器科技有限公司；Thermo-80℃低溫冰箱購自北京乾明基因技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 使用10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基培養PC-3細胞和RWPE-1細胞，放置于37℃，5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.2.2RT-qPCR檢測組織與細胞中miR-206和NFAT5的表達 使用液氮研磨前列腺癌患者和前列增生患者的前列腺組織，加入適量Trizol試劑提取組織總RNA。使用pultton 超微量分光光度計測定總RNA的純度和濃度。依據TransScript Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)試劑盒說明書將組織總RNA逆轉錄為總cDNA。依據2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑說明書進行熒光反應。反應條件：94℃ 2 min；95℃ 10 s；58℃ 30 s，40個循環。以U6為參照，進行數據統計學分析。使用磷酸緩沖液洗滌細胞后，采用胰酶消化液對細胞進行消化后提取RNA，步驟同上。

1.2.3熒光素酶報告基因檢測miR-206和NFAT5的結合 將pmir-GLO熒光素酶載體分別插入NFAT5的野生型3′-UTR和突變型(不能再與miR-206結合)3′-UTR，構建成重組NFAT5野生型3′-UTR質粒和NFAT5突變型3′-UTR質粒。在6孔板中培養PC-3后，將以下四種組合miR-206模擬物和NFAT5野生型3′-UTR質粒、miR-206模擬物 (miR-206 mimics)和NFAT5突變型3′-UTR質粒、miR-206對照 (miR206-NC)和NFAT5野生型3′-UTR質粒、miR-206對照和NFAT5突變型3′-UTR質粒通過脂質體共轉染293T細胞，培養36 h后根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性 。

1.2.4細胞轉染 取對數生長期的PC-3細胞，使用RPMI1640完全培養基將細胞濃度調整為3×106個/ml，接種200 μl細胞培養液至康寧六孔板中，放置于細胞培養箱中培養48 h。使用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent分別轉染miR-206模擬物和miR-206對照于細胞中，每組設置3個復孔。

1.2.5RT-qPCR檢測轉染后的細胞miR-206的表達 具體方法參照1.2.2。

1.2.6CCK8檢測細胞增殖 吸去轉染48 h后的PC-3細胞上清液，細胞消化后離心棄上清液，使用RPMI1640完全培養基調整細胞濃度為2×104個/ml，接種200 μl細胞培養液至康寧96孔板中，放置細胞培養箱中培養24 h。棄掉細胞上清液，使用磷酸緩沖液洗滌細胞，每孔加入配置好的CCK8 混合液(10 μl CCK8試劑和90 μl RPMI1640完全培養基)，置于細胞培養箱中孵育2 h后，使用酶標儀測定OD450。

1.2.7Transwell小室檢測細胞侵襲 將轉染48 h的PC-3細胞消化后，用無血清RPMI1640培養基將細胞濃度調整至4×105個/ml，取100 μl轉染后的細胞液接種于Transwell上室，下室加入600 μl含20%胎牛血清的RPMI1640完全培養基，并在Transwell上室與下室間的聚碳酸酯膜上鋪一層基質膠。然后放置于細胞培養箱中培養48 h。取出Transwell培養板，吸去小室上層中的液體并擦拭，倒扣小室，室溫放置8 min。采用4%甲醛固定15 min 并使用1%結晶紫進行染色，染色時間為5～10 min。最后置于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin蛋白水平的測定 將轉染48 h的PC-3細胞消化后，加入RIPA蛋白裂解液提取細胞蛋白并測定蛋白濃度。調整蛋白濃度后進行電泳過程，電泳結束后將蛋白轉印至PVDF膜中。轉膜結束后取出PVDF膜采用5%脫脂牛奶-TBST進行封閉，洗滌后分別與β-actin、NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin單克隆抗體孵育4℃ 12 h，洗滌后使用HRP標記的山羊抗人lgG二抗室溫孵育2 h，洗滌后進行ECL發光鑒定，掃描條帶后，使用ImageJ軟件分析條帶。

1.2.9NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin mRNA表達水平檢測 具體步驟參照1.2.2。引物見表1。

2 結果

2.1細胞和組織中miR-206和NFAT5的表達水平比較 前列腺癌組織miR-206表達水平顯著低于前列腺增生組織(圖1A)，而前列腺癌組織NFAT5表達水平顯著高于前列腺增生組織(圖1B)，并且兩者呈負相關關系(r=-0.934，P<0.000 1)，見圖1C。

圖1 細胞和組織中miR206和NFAT5的表達水平比較Fig.1 Comparison of expression levels of miR-206 and NFAT5 in cells and tissuesNote:A.The relative expression of miR-206;B.The relative expression of NFAT5;C.The relationship between the expressions of NFAT5 and miR-206.Compared with miR-206-NC,***.P<0.000 1.

2.2NFAT5是miR-206的靶向基因 生物信息學網站(http://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=mRNA)預測NFAT5與miR-206的結合位點，序列見圖2A。結果顯示，NFAT5野生型3′-UTR組中，與miR-206對照的PC-3細胞相比，miR-206模擬物組熒光素酶的活力值明顯降低(t=7.842，P=0.001 4)。但在NFAT5突變型3′-UTR組中，熒光素酶的活性無明顯變化(圖2B)，證明miR-206靶向調控NFAT5的3′-UTR，降低了熒光素酶的表達。

表1 RT-qPCR引物

Tab.1 Primer of RT-qPCR

Primer nameSequence(5′ to 3′)miR-206p FTGCTTCCCGAGGCCACATGCmiR-206 RGTGTGTGGTTTCGGCAAGTGU6 FGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATU6 RCGCTTCACGAATTTGCGTGTCATNFAT5 FCTGCTGGGATCCCTGAGATGTTCNFAT5 RGGTTTTCCAATGTTCCCCACGPCNA FAGCAGAGTGGTCGTTGTCTTTPCNA RTAGGTGTCGAAGCCCTCAGAE-cadherin FCATTTCTTGGTCTACGCCTGE-cadherin RGAGAGGAGTTGGGAAATGTGVimentin RGAGCAGCAGAATAAGATCCTGVimentin FCTTTGTCGTTGGTTAGCTGG

圖2 NFAT5是miR-206的靶向基因Fig.2 NFAT5 is a targeted gene of miR-206Note:A.Binding sites and sequences of NFAT5 to miR-206;B.Relative activity of luciferase.Compared with miR-206-NC,*.P<0.05.

2.3細胞增殖速率的比較 與miR206-NC比較，細胞轉染miR-206-mimics后，miR-206的表達水平顯著升高，轉染miR-206-mimics48和72 h后，PC-3細胞的增殖速率顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 細胞增殖速率的比較Fig.3 Comparison of cell proliferation rateNote:A.Relative expression of miR206;B.miR206 expression (OD) curve with time.Compared with miR-206-NC,*.P<0.05.

2.4細胞侵襲能力的比較 轉染miR-206-mimics后，與miR206-NC組比較，侵襲性PC-3細胞的數量明顯降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 細胞侵襲能力的比較Fig.4 Comparison of cell invasion abilityNote:A.Cell invasion map;B.Comparison of the number of cell invasion.Compared with miR-206-NC,*.P<0.05.

2.5NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin蛋白水平比較 與miR-206-NC組比較，miR-206-mimics組E-cadherin蛋白水平顯著升高，NFAT5、PCNA和Vimentin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖5。

圖5 NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin蛋白水平Fig.5 NFAT5,PCNA,E-cadherin and Vimentin protein levels

2.6NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin mRNA水平比較 與miR-206-NC組比較，miR-206-mimics組E-cadherin mRNA水平顯著升高，NFAT5、PCNA和Vimentin mRNA水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

圖6 NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin mRNA水平比較Fig.6 Comparison of NFAT5,PCNA,E-cadherin and Vimentin protein levelsNote:Compared with miR-206-NC,*.P<0.05.

3 討論

前列腺癌是發生于前列腺上皮的惡性腫瘤，主要包括腺癌、腺鱗癌及導管腺癌等，發病高峰年齡為55～70歲。由于前列腺癌生長速度緩慢，早期癥狀輕微，容易誤診、漏診和耽誤治療，導致五年生存率較低。前列腺癌的發生發展與mircoRNA密切相關。在前列腺癌中，mircoRNA在腫瘤發生發展中發揮了重要作用。研究報道，miR-221和miR-222促進PC-3細胞增殖及轉移的作用；miR-101抑制LNCap細胞增殖和轉移，并下調EZH2的表達[5,6]。目前，已有學者研究表明，miR-206可通過干擾CDK4和GAK的表達顯著抑制前列腺癌細胞的生長，也有學者研究表明，miR-206通過靶向Annexin A2調控上皮-間質轉化，抑制前列腺癌細胞的侵襲轉移[7,8]。由此可知，miR-206可以靶向結合調控多個mRNAs，通過不同途徑參與前列腺癌的發生發展。本文結果顯示，轉染miR-206后，前列腺癌PC-3細胞的增殖與侵襲能力顯著降低。

應用生物信息學數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=mRNA)預測，NFAT5存在miR-206的潛在的結合位點。本研究通過雙熒光素酶證實了miR-206和NFAT5的靶向關系。NFAT5，屬于NF-κB/Rel家族，是一種滲透壓轉錄因子，參與維持腎臟內髓部細胞內外滲透壓的平衡。目前研究表明，NFAT5在多種腫瘤中異常表達，參與了腫瘤發生發展[9]。并且很多研究都證實了NFAT5在腫瘤的促血管新生因子及血管新生的表達中發揮重要作用[10]。本文經研究發現NFAT5在前列腺癌中異常高表達，并與miR-206呈負相關關系。再次驗證了miR-206和NFAT5存在的靶向關系。

EMT被認為是前列腺癌發生骨轉移的主要原因。上皮細胞向間質細胞轉變(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)被激活后，細胞侵襲、遷移能力明顯增強，在體外則主要表現為Transwell透膜能力提高。有文獻報道，EMT是一個復雜的動態過程，N-cadherin、vimentin的表達水平增加，E-cadherin的低表達均可誘導EMT的發生[11]。E-cadherin是一類重要的細胞表面黏附分子，其主要功能是介導細胞黏附與遷移。近年來的研究表明，E-cadherin在肺癌等多種腫瘤中異常表達，對腫瘤的侵襲和轉移中起重要作用[12]。李俊堂等[13]發現NFAT5能夠結合在腫瘤轉移促進分子S100A4的啟動子區上，上調S100A4表達及活性。S100A4是Ca2+結合蛋白家族的成員之一，常被作為間質細胞的標志物，文獻報道在食管鱗狀細胞癌細胞中過表達S100A4可以抑制E-cadherin和促進vimentin的表達[14]。PCNA與細胞DNA合成關系密切，主要表達于G1期至S期的增殖細胞。越來越多的研究證實，其表達量是反應細胞增殖狀態的理想評價指標。沈薇等[15]研究表明，通過siRNA下調S100A4基因的表達能夠抑制U251細胞的增殖。因此本文檢測NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平，考察miR-206抑制前列腺癌細胞的增殖與侵襲作用機制。結果顯示，與miR-206-NC組比較，miR-206-mimics組E-cadherin 蛋白和mRNA水平顯著升高，NFAT5、PCNA、Vimentin蛋白和mRNA水平顯著降低，與上述文獻報道一致。

綜上所述，miR-206還有可能會通過調控NFAT5抑制前列腺癌細胞的增殖與侵襲的作用。本實驗的不足之處僅在細胞水平中研究miR-206的作用，后續將通過動物實驗探討miR-206在體內的作用。