果蔬和谷物制品中多菌靈的免疫檢測

柳 雙 ，謝春花 ，王敏思 ，張志軍 ，宋 洋

（1. 天津師范大學生命科學學院，天津300387； 2 . 天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3. 國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津），天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津300384）

多菌靈（Carbendazim），即 N-（2-苯并咪唑基）-氨基甲酸甲酯，是一種廣譜內吸性的苯并咪唑類殺菌劑，因其具有高效、低毒、內吸的特點，在農業生產上應用廣泛[1-3].近年來，由于多菌靈超范圍、超劑量使用的現象普遍存在，再加上不易被降解，導致農畜產品中多菌靈殘留超標問題嚴重[4-5].各種動物毒理實驗證實，一定劑量的多菌靈可能會引起動物的肝臟、生殖器官、分泌器官、免疫系統等的異常病理現象[6-7].多菌靈的過量使用也會影響作物產量、色素含量及營養價值等[8].目前，多菌靈在中國和歐盟多個國家（地區）被允許使用，由于其具有慢性毒性，因此國際食品法典委員會和中國（GB2763—2014）規定了食品中多菌靈的限量標準.其中，食莢豌豆、番茄、黃瓜、桃、蘋果、橙子的最大殘留限量（MRL）分別為 0.02、3.00、0.50、2.00、3.00、0.50 mg/kg.歐盟規定多菌靈在新鮮菇類中的MRL 為0.1 mg/kg[9]，韓國和英國規定多菌靈在食用菌中的MRL 為1 mg/kg，日本規定為3 mg/kg[10].目前，食品中多菌靈的定量仍以儀器法為主，主要是利用光譜技術和色譜技術.雖然隨著儀器設備的改進以及實驗條件的優化，這些儀器方法的準確度和檢出限逐漸降低（由mg/kg 到μg/kg），但也存在著儀器成本高、自動化程度低等問題.近年來，簡單、快速的新型免疫化學分析方法逐步建立并得以廣泛應用[11-12].

酶聯免疫吸附測定（ELISA）通過抗原抗體特異性反應和酶催化底物顯色反應的結合，將微量待測物信號轉化成酶的催化信號，由于酶的催化活性明顯高于化學催化劑的催化活性，因此反應信號被放大，達到了檢測痕量物質的目的[13-15].如Uclés 等[16]建立了競爭ELISA 方法檢測葡萄和葡萄酒中的多菌靈、 抑菌唑和噻菌靈殘留，該方法的線性范圍為10.0～80.0 μg/kg；Yan 等[17]基于氨基甲酸酯單克隆抗體建立ELISA 法，用以檢測蘋果、黃瓜、西紅柿中的多菌靈含量，工作范圍為0.06～7.47 ng/mL.這些研究實現了多菌靈的靈敏檢測.

本研究基于多菌靈多克隆抗體，經過簡單快速的前處理過程和反應條件的優化，建立了蔬菜、果汁和谷物中多菌靈殘留的直接競爭ELISA 檢測方法（CDELISA），并用傳統的高效液相色譜法對其進行驗證，最后采用該方法對香菇、小麥、黃瓜、橙子、橙汁的30個樣品進行了實際樣品檢測.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器：全波長酶標儀（Labsystems），美國雷勃公司；96 孔酶標板，丹麥Nunc 公司；高效液相色譜儀，美國Agilent Technologies 公司；多功能食品加工機，中國帥佳電子科技有限公司.

試劑：多菌靈，加拿大TRC 公司；過氧化氫脲、3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB），美國 Sigma 公司；PSA 吸附劑（40～60 μm），美國 Sepax Technologies，Inc公司；牛血清白蛋白（BSA）、β-環糊精，德國Merck 公司；二甲基亞砜（DMSO），J&K 公司；酶標二抗（羊抗兔，5000），上海斯信生物技術有限公司； 硫酸（分析純）、冰醋酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），天津市化學試劑供銷公司；多菌靈多克隆抗體、多菌靈包被原（半抗原與雞卵白蛋白的耦聯化合物），本課題組合成.

pH 值為9.6 的碳酸鈉緩沖液（包被緩沖液），磷酸氫二鉀溶液（0.066 mol/L, pH 為 9.0），PBS（0.01 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH = 7.4），PBST（1 L PBS 加 0.5 g 吐溫），PBSB（100 mL PBS+0.1 g BSA）.

1.2 多菌靈CD-ELISA 方法的建立

不同反應條件對ELISA 中抗原抗體的特異性識別和酶與底物的顯色放大反應均有不同程度的影響，甚至是阻止反應進行，考慮到參與反應的抗體和酶所具備的特性，一般影響較大的反應條件有溶液的離子濃度、pH 值以及有機試劑的含量等.本研究對這些反應條件進行了優化.

1.2.1 酶標抗原稀釋倍數的優化

利用CD-ELISA 法，抗體包被量為每孔1 μg，用酶標儀進行雙波長（450 nm 和650 nm）檢測，選擇吸光度在0.8～1.2 間的酶標抗原稀釋倍數為最優[18]. 具體操作步驟如下.

①包被：抗體包被量為每孔1 μg，37 ℃下孵育3 h，PBST 沖洗 3 次；②封閉：每孔中加入 200 μL 質量分數為0.5%的脫脂奶粉，室溫靜置1 h，PBST 沖洗4 次；③競爭實驗：空白孔加入100 μL PBS，實驗組分別加入3 倍梯度稀釋的酶標抗原100 μL，室溫孵育1 h，PBST 沖洗 5 次；④顯色：每孔加入底物液 150 μL，避光室溫靜置15 min 后，加入終止液終止反應；⑤測定吸光度.

1.2.2 抗體包被量的優化

設置酶標抗原稀釋倍數為1.2.1 中優化的最佳稀釋倍數，標準品多菌靈的質量濃度分別為0.042、0.128、0.640、1.600、3.200、6.400 μg/kg，選擇 IC50值最低時的抗體包被量為最優[18].具體操作步驟如下.

①包被：抗體包被量分別為每孔 0.5、1.0、2.0 μg，37 ℃恒溫孵育 3 h，PBST 沖洗 3 次；②封閉：操作方法同 1.2.1；③競爭實驗：A 行的孔（空白孔）加入 100 μL PBS，B 行的孔（對照孔）加入 50 μL PBS 和 50 μL 以最佳稀釋倍數稀釋的酶標抗原，C～H 孔加入50 μL 酶標抗原和50 μL 多菌靈標準溶液（從低濃度到高濃度），室溫孵育1 h 后，PBST 沖洗5 次；④、⑤步驟同1.2.1節.

1.2.3 緩沖液條件的優化

配制緩沖液，使其離子濃度分別為 10、20、30、40、50 mmol/L，pH 值分別為 4.5、5.5、6.5、7.4、8.5、9.5，用以稀釋酶標抗原和多菌靈.反應在96 孔酶標滴定板中進行，用酶標儀讀取A450和A650數值，最后根據結果中IC50值的大小和吸光度的變化選擇最佳反應條件.

1.2.4 多菌靈CD-ELISA 方法的建立

利用以上優化條件，將多菌靈標準品配制成質量濃度分別為 0.042、0.128、0.640、1.600、3.200、6.400、12.800、25.600 μg/kg 的標準品溶液，進行 CD-ELISA實驗.以多菌靈標準品的濃度（μg/kg）為橫坐標，以抑制率（%）為縱坐標繪制標準曲線.

抑制率（IC）=[（Acontrol-Ax）/（Acontrol-A空白）]×100%式中：Acontrol為標準品濃度為零時的吸光度；Ax為標準品濃度為x 時的吸光度；A空白為空白孔的吸光度.

1.3 抗體特異性的評估

通過抗原及其結構類似物與抗體的交叉反應率（CR）來判斷抗體的特異性[19-20]. 本研究選用的抗原結構類似物包括：苯菌靈（Benomyl）、托布津（Thiophanate）、速滅威（MTMC）、2-氨基苯并咪唑（2-Aminobenzimidazole）、噻苯咪唑（Thiabendazole）、甲基硫菌靈（Thiophanate-Methyl）.

CR（%）=[IC50（多菌靈）/IC50（compound）]×100式中：IC50為抑制率為50%對應的標準品濃度.

1.4 消除基質影響

樣品中的一些化合物，如色素、鹽、糖等都可能影響抗原抗體的結合或抑制酶的活性[19].一般情況下，簡單稀釋就足以消除基質影響，而且稀釋倍數的增大通常都伴隨著基質影響的減小，但考慮到方法的檢測限（LOD）和靈敏度，稀釋倍數不能太大[20].因此，在保持稀釋倍數盡可能小的情況下，使用一些掩蔽劑（PSA）或表面活性劑（Tween-20）來減小基質的影響和提高方法靈敏度.為了盡可能減小基質影響，本研究對基質的稀釋倍數、掩蔽劑和表面活性劑的用量進行優化.

1.5 CD-ELISA 方法評估的樣品準備

分別選擇水果（橙子）、果汁（橙汁）、蔬菜（黃瓜）、谷物（小麥）和食用菌（香菇）為樣品評估CD-ELISA 方法的各項性能指標，樣品均來自天津當地市場.在添加回收實驗前，每個樣品都通過高效液相色譜法檢測確保其不含有多菌靈和苯菌靈.將樣品的可食用部分用食品加工機切碎，儲存在-20 ℃下備用.

1.6 樣品前處理和高效液相色譜檢測

1.6.1 CD-ELISA 檢測的樣品處理

（1）固體樣品：稱取1 g 經勻漿預冷的樣品，加入0.4 g 無水硫酸鈉、0.1 g 無水乙酸鈉、1 mL 醋酸和乙腈混合液（體積比為 1 ∶99），震蕩 2 min，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min.取上清液加入 0.02 g PSA 吸附劑，渦旋 30 s，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取上清液.

（2）液體樣品：取 1 mL 預冷的樣品，加入 1 mL 體積分數為1%的酸化乙腈，震蕩2 min，加入0.1 g 無水硫酸鈉、0.025 g 無水乙酸鈉、0.025 g 氯化鈉和0.02 g PSA 吸附劑，渦旋 30 s，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取上清液.

處理后的樣品儲存于棕色小瓶中，置于-20 ℃下備用，用緩沖液稀釋即可進行CD-ELISA 檢測.

1.6.2 高效液相色譜檢測的樣品處理

（1）固體樣品：處理方法參考文獻[21].稱取40 g 經勻漿預冷的樣品，加入16 g 無水硫酸鈉、2 g 無水乙酸鈉和40 mL 體積分數為1%的酸化乙腈，震蕩2 min，4 ℃下靜置15 min.取上清液加入0.8 g PSA 吸附劑和3.2 g無水硫酸鈉，渦旋 30 s，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取15 mL 上清液，45 ℃下減壓旋蒸至1 mL.

（2）液體樣品：取40 mL 預冷的樣品，加入40 mL體積分數為1%的酸化乙腈，震蕩2 min，加入0.8 g PSA 吸附劑、8 g 無水硫酸鈉、2 g 氯化鈉和 2 g 無水乙酸鈉，渦旋 30 s，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取 15 mL上清液，45 ℃下減壓旋蒸至1 mL.

處理后的樣品儲存于棕色小瓶中，-20 ℃備用，經0.22 μm 濾膜過濾后用以檢測.

1.6.3 高效液相色譜的檢測條件

高效液相色譜儀為安捷倫1200 系列，C18 柱（250 mm×4.6mm，5μm）.反應條件：進樣體積為20μL，流速為1.0 mL/min，波長為286 nm，流動相為甲醇和水的等體積混合物.最終以進樣濃度為橫坐標，以對應峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并求出線性回歸方程.

1.7 添加回收實驗和實際樣品檢測

評價準確度的方法有標樣對照實驗、方法對照實驗和添加回收實驗[22].本研究利用添加回收實驗評估CD-ELISA 的準確度.分別對橙子、橙汁、黃瓜、小麥以及香菇這5 種食物的樣品進行加標回收實驗（經檢驗不含多菌靈和苯菌靈），每種樣品分別添加3 個濃度（10、20、40 μg/kg），每個濃度重復 3 次.樣品提取液經CDELISA 法分別檢測后，計算其回收率（Recovery rate），根據回收率接近100%的程度來檢驗方法的準確度.

回收率（%）=（測定值-空白值）/添加量×100

對橙子、橙汁、黃瓜、小麥及香菇進行抽樣調查，每種抽取6 個樣品進行多菌靈殘留的檢測.

2 結果與分析

2.1 CD-ELISA 法的建立

本研究確定CD-ELISA 法的最優條件為：酶標抗原稀釋300 倍，抗體包被量為每孔0.5 μg，磷酸緩沖液濃度為10 mmol/L，pH 值為7.4，抗原抗體競爭反應時間為30 min.多菌靈標準曲線如圖1 所示.由圖1 可以看出，多菌靈質量濃度與抑制率呈正比，IC15=（0.30 ±0.08）μg/L，IC50=（2.00 ± 0.57）μg/L.

圖1 多菌靈標準曲線Fig.1 Carbendazim standard curve

2.2 抗體特異性的評價

利用CD-ELISA 法測定抗體與多菌靈及其結構類似物的交叉反應來評價抗體的特異性，結果如表1所示.

表1 化合物與抗體的交叉反應率和IC50 值Tab.1 IC50 and CR of compounds and antibody

由表1 可以看出，該抗體可以特異性地識別多菌靈，與苯菌靈也有較高的交叉反應率（CR=56.80%），這可能是因為苯菌靈的有效成分就是多菌靈；抗體與硫菌靈和甲基硫菌靈的CR 分別為3.90%和2.10%，可能是由于二者具有2 個長鏈的與苯并咪唑環相似的苯環結構，因此與抗體有一定的親和性；與其他苯并咪唑類和氨基甲酸甲酯類化合物的CR 小于0.25%.

2.3 CD-ELISA 的校正曲線及基質曲線

多菌靈校正曲線的最優制備條件為：抗體包被量為每孔0.5 μg，封閉時間為60 min，多菌靈標品（0.042、0.128、0.640、1.600、3.200、8.000、16.000、80.000 μg/L）和酶標抗原（稀釋300 倍）的稀釋液為含有0.5%吐溫-20 的 PBS（10 mmol/L，pH 7.4），抗原抗體競爭反應時間為30 min，檢測過程僅需要2 h.繪制校正曲線，線性范圍為0.4～580.0μg/L，即抑制率為20%～80%所對應的多菌靈濃度，IC15=（0.30±0.15）μg/L，IC50=（2.70±0.30）μg/L.

將香菇、小麥、橙汁、橙子和黃瓜樣品提取液經PBSB 稀釋20 倍后的溶液作為酶標抗原和多菌靈標品的稀釋液，經CD-ELISA 檢測獲得的抑制率曲線即為樣品的基質曲線，結果如圖2 和表2 所示.

圖2 多菌靈CD-ELISA 校正曲線及基質曲線的比較（以香菇、橙子為例）Fig.2 Comparison of calibration curves and matrix curves of CD-ELISA（taking mushroom and orange as examples）

表2 多菌靈CD-ELISA 法校正曲線與各樣品基質曲線的比較Tab.2 Comparison between calibration curve and matrix curves of carbendazim in CD-ELISA %

5 種樣品的基質曲線與校正曲線幾乎重合，由此可知，樣品的前處理方法完全可以達到消除基質影響的目的，且該校正曲線至少可以用于這5 種樣品的多菌靈殘留檢測.

2.4 CD-ELISA 法各項指標的評估

2.4.1 檢測限和靈敏度

在CD-ELISA 方法中，檢測限是IC15，即抑制率為15%時所對應的待測物中多菌靈的濃度，靈敏度是IC50，即抑制率為50%時所對應的待測物中多菌靈的濃度.根據多菌靈CD-ELISA 的校正曲線可知，檢測限為（0.30±0.15）μg/L，靈敏度為（2.70±0.30）μg/L.

2.4.2 添加回收實驗

對不含多菌靈的橙汁、橙子、黃瓜、香菇和小麥樣品進行加標回收實驗，結果如表3 所示.

表3 多菌靈在5 種樣品中的添加回收率Tab.3 Recovery rates of carbendazim in five kinds of samples by CD-ELISA

由表3 可以看出，5 種樣品的提取液經CD-ELISA法分別檢測后，回收率為84.3%～112.7%，變異系數（CV）小于12.3%.

2.4.3 高效液相色譜法與CD-ELISA 法的對照

根據高效液相色譜法得到多菌靈的線性回歸方程y=49.627x+2.524 4，相關系數為0.999 9.以香菇和小麥為材料，分別采用HPLC 和CD-ELISA 的前處理方法對樣品進行處理后，同時用2 種方法進行檢測，結果如表 4 和圖 3 所示.其中，CD-ELISA 法的 回收率為89.7%～112.7%，平均為99.7%，變異系數低于11.0%；HPLC 法的回收率為 79.3%～104.9%，平均為95.5%，變異系數低于4.8%.雖然CD-ELISA 法回收率的集中程度略低于HPLC 法，但更接近100%.從圖3可以看出，2 種方法的檢測結果呈線性關系，相關系數為0.9933，說明二者具有較高的一致性，即檢測多菌靈殘留的新方法CD-ELISA 具有接近國標儀器法的準確度，能被應用于食品中多菌靈殘留的快速檢測.

表4 CD-ELISA 法與HPLC 法的比較Tab.4 Comparison between CD-ELISA and HPLC %

圖3 HPLC 與CD-ELISA 的結果相關性Fig.3 Correlation between HPLC and CD-ELISA

2.5 實際樣品檢測結果

對天津市場的橙子、橙汁、黃瓜、小麥及香菇進行抽樣調查，每種抽取6 個樣品進行多菌靈殘留的檢測，結果如表5 所示.由表5可以看出，小麥和香菇的多菌靈檢出率較高，均達到50%，但小麥6 個樣品中的多菌靈含量均較低，香菇的含量較高，多菌靈超標率達到16.67%； 橙子和黃瓜的檢出率分別為16.67%和33.33%，黃瓜有2 個樣品的多菌靈含量較高，但未超標.橙汁的檢出率和超標率均為0.多菌靈對所有樣品的整體檢出率為30%，超標率為3.33%.

表5 實際樣品中多菌靈的檢測Tab.5 Detection of carbendazim in actual samples

3 結語

本研究基于多菌靈多克隆抗體，建立了快速、高效、靈敏的CD-ELISA 法，用以檢測食品中多菌靈的殘留.最終確定多菌靈CD-ELISA 校正曲線的最優制備條件為：抗體包被量為每孔0.5 μg，酶標抗原稀釋300 倍，多菌靈標準品和酶標抗原（稀釋300 倍）的稀釋液為含有 0.5 %吐溫-20 的 PBS（10 mmol/L，pH 7.4）. 樣品僅需經過1 倍的酸化乙腈提取（醋酸和乙腈的體積比為1 ∶99），提取液用PBSB 緩沖液稀釋20 倍即可用于CD-ELISA 檢測.繪制的校正曲線：IC15=（0.30±0.15）μg/L，IC50=（2.70 ± 0.30）μg/L，線性范圍為 0.40～58.0 μg/L.整個檢測時間僅需2 h，達到了快速檢測的目的，滿足了國家對食品中多菌靈的限量標準.因此，CD-ELISA法可以作為食品中多菌靈殘留的快速檢測手段.