不同毒株豬偽狂犬病活疫苗的穩(wěn)定性和體液免疫效果評價(jià)

陳弟詩 ，周遠(yuǎn)成，陳斌，周麗媛，裴超信，張毅，李麗，丁夢蝶

（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610200）

豬偽狂犬病毒（PRV）是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科的雙鏈DNA 病毒，基因組全長約150 kb。PRV 可感染多種動物，以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、繁殖障礙、呼吸道癥狀和腦脊髓炎為主要特征。豬是PRV最主要的天然宿主和儲存宿主，PRV 感染后的臨床癥狀與豬的年齡、免疫狀態(tài)及毒株毒力密切相關(guān)，通常情況下易感豬群年齡越小，感染后的發(fā)病率和死亡率越高，無母源抗體的幼齡仔豬感染后死亡率甚至高達(dá)100%[1-2]。PRV具有嗜神經(jīng)特性，通過不同途徑感染均可沿神經(jīng)通路傳播，定植于三叉神經(jīng)節(jié)而終身帶毒，在豬免疫力下降、藥物刺激或應(yīng)激條件下，潛伏的PRV可被激活重新復(fù)制并向環(huán)境中排出病毒[3]。目前很多國家已經(jīng)成功根除該病，而我國一直存在著PRV的感染和流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。

偽狂犬病尚無特效藥物可以治療，疫苗免疫是防控該病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。目前，市場上有多種疫苗可供選擇，包括滅活疫苗、自然缺失弱毒活疫苗和人工基因缺失弱毒活疫苗等。鑒于PRV的嗜神經(jīng)傳播特性，活疫苗才是防控偽狂犬病的首選疫苗，雖然國內(nèi)有滅活疫苗的推廣，但滅活疫苗必須配合活疫苗的使用方能達(dá)到理想的效果，因此活疫苗的免疫效力是偽狂犬病免疫成功的關(guān)鍵。為評價(jià)臨床上不同毒株偽狂犬病活疫苗的穩(wěn)定性和免疫效力，本試驗(yàn)選擇了市場上多個(gè)毒株的活疫苗包括Bartha K61株（進(jìn)口和國產(chǎn)）、C 株、SA215 株、HB98 株、HB2000 株進(jìn)行比較研究。希望通過不同毒株免疫效果的比較，為臨床上豬偽狂犬病活疫苗的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒種、細(xì)胞與抗體檢測試劑盒 豬偽狂犬病活疫苗Bartha K61 株（進(jìn)口）、Bartha K61 株（國產(chǎn)）、C 株、SA215株、HB98株、HB2000株，均購于相應(yīng)生產(chǎn)或代理企業(yè)，所購疫苗去除標(biāo)簽后隨機(jī)標(biāo)記為A、B、C、D、E、F。PRV gE 蛋白、gB 蛋白抗體ELISA檢測試劑盒購于IDEXX，PRV XJ株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心分離鑒定，MDBK細(xì)胞由畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 40 頭體重相近、臨床表現(xiàn)正常的DLY（杜洛克×長白×約克夏）斷奶仔豬，購于四川省眉山市某豬場。所有仔豬均飼養(yǎng)于畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的動物房，嚴(yán)格在隔離條件下飼養(yǎng)。

1.3 不同疫苗的穩(wěn)定性測試 將疫苗A～F 分別用配套疫苗稀釋液按照瓶簽標(biāo)注頭份數(shù)稀釋，稀釋后立即取稀釋疫苗接種生長良好的MDBK 細(xì)胞，測定病毒含量；剩余疫苗在常溫下存放，1、2、3、4 h 后分別取樣測定病毒含量。添加病毒液于37 ℃5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)96 h，觀察細(xì)胞病變情況，使用Reed-Muench法計(jì)算結(jié)果。

1.4 免疫方案 將40頭仔豬隨機(jī)分為8組，每組5 頭，隔離飼養(yǎng)7 d，觀察無異常癥狀后分別免疫A、B、C、D、E、F疫苗（標(biāo)記為1～6組），第7組免疫含有PBS稀釋液的偽狂犬病活疫苗D（標(biāo)記為DPBS組），第8組不免疫作為陰性對照。

免疫前和免疫后7、14、21、28 d 分別采集前腔靜脈血，使用PRV gE 和gB 蛋白抗體試劑盒分別測定gE和gB抗體。選擇免疫后28 d采集的血清樣品，用RPV XJ株或其他毒株按照《中華人民共和國獸藥典》附錄記載的方法測定中和抗體，并記錄結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同毒株偽狂犬病活疫苗稀釋后的穩(wěn)定性測試結(jié)果 所有立即稀釋的疫苗病毒含量均大于105.5TCID50/頭份，個(gè)別疫苗含量高達(dá)106.57TCID50/頭份（結(jié)果見表1）。使用疫苗配套的稀釋液稀釋后于常溫下放置不同的時(shí)間，測得不同疫苗株的穩(wěn)定性差別較大。進(jìn)口豬偽狂犬病活疫苗和個(gè)別國產(chǎn)疫苗在稀釋后2 h 內(nèi)穩(wěn)定，大部分國產(chǎn)疫苗稀釋后2 h 內(nèi)病毒含量均有下降，某國產(chǎn)活疫苗稀釋后1 h 的病毒含量下降達(dá)50%，稀釋后4 h病毒含量僅為稀釋前的14.79%，但所有疫苗稀釋后4 h的病毒含量均高于105.2TCID50/頭份，參照國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)（豬偽狂犬病活疫苗的病毒含量為105.0TCID50/頭份），所有疫苗均符合質(zhì)量要求。

表1 不同毒株偽狂犬病活疫苗稀釋后的穩(wěn)定性比較

2.2 不同毒株偽狂犬病活疫苗免疫后gE 和gB ELISA 抗體的測定結(jié)果 使用PRV gB 和gE蛋白抗體ELISA試劑盒分別測定8組仔豬在免疫前和免疫后不同時(shí)間點(diǎn)采集的血清抗體，結(jié)果得出所有仔豬的gE 抗體均為陰性，所有仔豬在免疫后7 d的gB抗體均為陽性，在28 d內(nèi)S/N值不斷降低，不同疫苗間gB 抗體的變化趨勢一致，通過測定的S/N值比較，不同疫苗間差異不顯著（圖1）。

2.3 中和抗體效價(jià)的測定結(jié)果 免疫后28 d，采集所有仔豬血清，使用新分離的偽狂犬病毒基因2型變異株XJ株進(jìn)行中和抗體效價(jià)測定，結(jié)果見表2。

分別使用不同毒株進(jìn)行中和抗體試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)6 種市售疫苗除F 外，其余疫苗免疫后28 d 對PRV 2 型變異株XJ 株的中和抗體均較低。在臨床中某些疫苗攜帶有專用的免疫增強(qiáng)劑型稀釋液，為驗(yàn)證專用稀釋液能否提高疫苗免疫后的中和抗體水平，本試驗(yàn)選擇自帶專用稀釋液的疫苗D 進(jìn)行測定，分別使用疫苗D 自帶的專用稀釋液和常規(guī)PBS 緩沖液按說明稀釋，然后免疫仔豬。免疫后28 d 采集專用稀釋液免疫組和常規(guī)PBS 稀釋液免疫組的仔豬血清，分別使用疫苗D和PRV XJ 株進(jìn)行中和抗體的測定。結(jié)果顯示：疫苗D無論是使用常規(guī)PBS液稀釋還是使用專用稀釋液稀釋，其針對PRV 2型XJ株的中和抗體效價(jià)均低于10，但均能產(chǎn)生針對本疫苗的中和抗體。使用含免疫增強(qiáng)劑的專用稀釋液稀釋的D疫苗在免疫仔豬28 d后，中和抗體效價(jià)平均值為37.05，而使用PBS稀釋液組的中和抗體效價(jià)平均值為28.93，前者明顯高于后者。可見疫苗D雖然能夠誘導(dǎo)針對自身的高效價(jià)中和抗體，但是無論是否使用免疫增強(qiáng)劑，均不能誘導(dǎo)針對豬偽狂犬病毒2型XJ株的等效中和抗體。

圖1 不同毒株偽狂犬病活疫苗免疫后gB抗體的測定結(jié)果

表2 不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后28 d血清中和抗體效價(jià)的測定結(jié)果

3 討論

豬偽狂犬病毒具有皰疹病毒的典型特征，感染豬后可以潛伏在豬外周神經(jīng)組織中形成隱性感染，在免疫抑制性藥物、應(yīng)激條件或某些疾病感染等因素的刺激下會誘發(fā)PRV 的再次復(fù)制和排毒[4]。隱性感染豬的排毒可能會對豬群造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)濟(jì)損失的多少取決于豬群的群體免疫力。在豬偽狂犬病防控中，綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益和凈化成本，豬場需要選擇是執(zhí)行免疫凈化的策略還是免疫防控的策略。無論如何選擇，當(dāng)前形勢下對PRV 疫苗的合理選擇和使用始終是防控偽狂犬病的關(guān)鍵。因此，如何去評價(jià)當(dāng)前臨床上使用的各種豬偽狂犬病活疫苗顯得尤為重要。

3.1 豬偽狂犬病活疫苗的免疫效果評價(jià) 對疫苗效果的評價(jià)主要從免疫學(xué)效果和安全性兩方面入手。安全性評價(jià)可以通過觀察免疫后豬群的群體表現(xiàn)來得到比較直觀的結(jié)果。免疫學(xué)效果通常采用血清學(xué)方法或攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評價(jià)，多數(shù)疫苗的血清學(xué)抗體指標(biāo)與攻毒保護(hù)率呈正相關(guān)。在臨床條件下使用攻毒實(shí)驗(yàn)去評價(jià)豬偽狂犬病活疫苗是否對田間野毒株有效，可能會導(dǎo)致散毒而對豬場造成毀滅性的打擊，因此使用血清學(xué)方法更為簡單有效。血清學(xué)評價(jià)手段可以采用ELISA 測定免疫抗體，或者采用血清中和實(shí)驗(yàn)測定中和抗體。由于中和抗體測定需要一定的實(shí)驗(yàn)條件，而多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不具備這些條件，因此臨床上更多的是通過ELISA 來監(jiān)控疫苗免疫效果。

本試驗(yàn)選擇了6種不同毒株的常用疫苗來免疫仔豬，然后分別使用ELISA 和中和抗體測定兩種方法來進(jìn)行豬偽狂犬病活疫苗的免疫學(xué)效果評價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同疫苗免疫后ELISA 抗體的產(chǎn)生規(guī)律基本一致，組間無顯著性差異；而使用當(dāng)前流行毒株XJ株進(jìn)行中和抗體測定后發(fā)現(xiàn)，市售的大多數(shù)疫苗在免疫后28 d 并不能誘導(dǎo)針對XJ株的高效價(jià)中和抗體。因此，針對豬偽狂犬病活疫苗的免疫學(xué)效果評價(jià)，只有在使用當(dāng)前流行毒株進(jìn)行中和抗體測定后才能篩選到優(yōu)秀的豬偽狂犬病活疫苗。

3.2 豬偽狂犬病活疫苗的穩(wěn)定性評價(jià) 隨著動物生物制品生產(chǎn)工藝的革新，科研人員開發(fā)出了多種耐熱保護(hù)劑，耐熱保護(hù)劑的出現(xiàn)使得疫苗在運(yùn)輸和使用過程中可以耐受更高的環(huán)境溫度，與普通凍干保護(hù)劑相比，耐熱保護(hù)劑在37 ℃下依然能夠長時(shí)間地維持凍干疫苗滴度不發(fā)生變化，使得疫苗的運(yùn)輸和使用更為方便。但到目前為止，人們只關(guān)心耐熱保護(hù)劑或常規(guī)保護(hù)劑在凍干狀態(tài)下對疫苗的保護(hù)能力，而缺乏對凍干疫苗稀釋后穩(wěn)定性的研究。本試驗(yàn)選擇了多種臨床上常用的豬偽狂犬病毒凍干活疫苗，對其稀釋后的穩(wěn)定性進(jìn)行了測試，分別使用疫苗自帶的稀釋液按照使用說明書進(jìn)行稀釋，稀釋后于不同時(shí)間點(diǎn)取樣測定不同毒株偽狂犬病活疫苗中的病毒含量，結(jié)果顯示：不同疫苗稀釋后的穩(wěn)定性有差異，隨著稀釋時(shí)間的延長病毒含量持續(xù)下降，部分耐熱保護(hù)劑活疫苗稀釋后1 h 的病毒含量下降約50%，稀釋4 h后部分疫苗病毒含量下降最高可達(dá)85.21%。這提示人們在使用疫苗時(shí)需要現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置，也提示疫苗研發(fā)人員在關(guān)注凍干保護(hù)劑耐熱能力的同時(shí)，還應(yīng)關(guān)注凍干疫苗稀釋后的穩(wěn)定性。