一種快速建立小鼠心肌缺血再灌注模型的方法

臧光耀，李波，耿田欣，嚴金川

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

2017年中國心血管病報告顯示，我國心血管疾病仍然是嚴重威脅居民生命健康的首要疾病，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是其中常見的致死病因[1]。溶栓、冠脈介入和搭橋等再灌注治療可明顯改善AMI患者的預(yù)后，但心肌缺血再灌注會誘發(fā)一系列明顯的組織損傷和無菌性炎癥反應(yīng)，影響患者預(yù)后[2]。因此，建立穩(wěn)定有效的小鼠心肌缺血再灌注模型有助于為研究AMI提供可靠的依據(jù)。

以往的心肌缺血再灌注模型多集中于兔、豬等動物，近年來大鼠模型的應(yīng)用逐漸增多。但小鼠繁殖力強、便于養(yǎng)殖，并且近年來基因敲除小鼠得到廣泛應(yīng)用，用小鼠建立心肌缺血再灌注模型對研究AMI和心肌缺血再灌注的損傷和修復(fù)具有重要意義[3-4]。目前國內(nèi)對小鼠心肌缺血再灌注模型的建立報道較少，且建立過程中需要對動物進行通氣輔助呼吸操作并二次開胸，耗時長，對動物損傷大，極易造成動物死亡。本研究針對以上問題，參照國內(nèi)外已有的模型構(gòu)建方法[5-7]，探討一種無需借助呼吸機和開胸操作的方法建立心肌缺血再灌注模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只健康SPF級昆明小鼠，雄性，體重18～25 g，6～8周齡，購于江蘇大學(xué)動物實驗中心，動物合格證編號:201924287。隨機分為假手術(shù)組、缺血15 min+再灌注24 h組、缺血30 min+再灌注24 h組和缺血45 min+再灌注24 h組，每組10只。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準同意。

1.2 儀器和試劑

手術(shù)縫合線、顯微外科手術(shù)器械、XR300小動物麻醉機、XR-RM6240小動物心電圖機(上海欣軟信息科技有限公司 )；小動物手術(shù)燈、異氟烷、75%乙醇、2% TTC染色劑、0.5%伊文思藍 (Evans Blue) 染色液均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 模型建立

手術(shù)過程如下： ① 小鼠用2%異氟烷麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上，小鼠痛覺消失后，接上心電圖機獲得穩(wěn)定的Ⅱ肢體導(dǎo)聯(lián)。② 消毒小鼠胸部毛發(fā)，在胸骨左側(cè)第3、4肋間沿胸大肌邊緣做一長1 cm左右切口，鈍性分離皮下組織、胸大肌和前鋸肌，用蚊式鑷穿過第3、4肋間，快速擠出心臟。③ 在光源下，于左心耳下1～2 mm處找到冠狀動脈左前降支(LAD)，選用6-0絲線，結(jié)扎LAD，進針深度約1 mm，寬度1～2 mm，避免穿透心臟。結(jié)扎線打成活結(jié)，近針端剪短，遠針端線頭留3～4 cm于胸腔外。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。④ 結(jié)扎后可見結(jié)扎處以下心室壁變成暗紅色，將心臟緩慢推入胸腔內(nèi)。擠出胸腔內(nèi)氣體，胸壁切口作一荷包結(jié)打緊，關(guān)上胸腔，將結(jié)扎線頭留于胸外用于冠脈再通。 ⑤ 結(jié)扎后5 min內(nèi)密切觀察心電圖改變。⑥ 拿下麻醉面罩，小鼠會在2～3 min內(nèi)蘇醒，整個構(gòu)建心肌缺血的時間控制在1 min內(nèi)完成； ⑦ 手術(shù)組小鼠分別于缺血15、30和45 min后，緩慢拉出結(jié)扎線，恢復(fù)心肌血流供應(yīng)。⑧ 24 h后，記錄心電圖數(shù)據(jù)并進行伊文思藍-TTC染色。

1.4 伊文思藍-TTC染色

再灌注24 h后，將小鼠麻醉接呼吸機維持呼吸，開胸后重新結(jié)扎LAD，迅速分離出主動脈弓，在主動脈弓上做一切口，將1 mL注射器固定于主動脈內(nèi)，將0.5%的伊文思藍溶液注入心臟；約1 min后剪下心臟，迅速放入生理鹽水中反復(fù)沖洗，將心腔內(nèi)血液洗干凈，并快速將心臟放入-80 ℃冰箱中冷凍8～10 min后取出，沿與心臟長軸垂直平面，用手術(shù)刀片由心尖部到心底部將心臟切為約1 mm切片5～6片。將切片解凍后放入TTC溶液中，并放入37 ℃環(huán)境中避光孵育4～5 min后取出，干燥后放入4%多聚甲醛溶液中固定12 h。固定結(jié)束后拍照，并用Image J軟件計算梗死區(qū)(IA)、缺血危險區(qū)(AAR)和心肌總面積(左心室面積，LV)。參考文獻[8]方法，用IA/(AAR+IA)來評價心肌梗死的面積，用(AAR+IA)/LV評價缺血區(qū)面積。

2 結(jié)果

2.1 小鼠造模成功率

40只小鼠手術(shù)過程中，假手術(shù)組存活率100%，手術(shù)組中由于縫合針進針太深導(dǎo)致心臟出血死亡小鼠1只，術(shù)后胸腔排氣不完全導(dǎo)致氣胸死亡小鼠2只，術(shù)后取材伊文思藍-TTC染色結(jié)果顯示未成功結(jié)扎LAD小鼠1只。手術(shù)組小鼠存活率90%，缺血再灌注造模成功率 86.7%(26/30)。

2.2 形態(tài)學(xué)改變

成功結(jié)扎LAD后，可見結(jié)扎線以下心臟呈灰白色，心臟搏動頻率和幅度減弱。再灌注24 h開胸可見與周圍組織分界明顯的蒼白梗死區(qū)。見圖1。

圖1 結(jié)扎LAD后心臟形態(tài)變化

2.3 伊文思藍-TTC染色

如圖2所示，梗死的心肌組織呈白色，不能被伊文思藍和TTC染色；危險區(qū)呈紅色，被TTC染色，不能被伊文思藍染色，代表缺血但是還活著的心肌組織，可作為缺血再灌注損傷指標；遠端區(qū)呈藍色，被伊文思藍和TTC同時染色，代表正常心肌組織。缺血45 min+再灌注24 h組小鼠IA/(AAR+IA)為(46.7±5.77)%，(AAR+IA)/LV為(63.8±6.36)%。

圖2 小鼠心肌缺血再灌注后心臟伊文思藍染色

2.4 小鼠心肌缺血再灌注前后心電圖變化

心電圖檢測顯示，與手術(shù)前相比，LAD結(jié)扎5 min后小鼠出現(xiàn)T波高聳，ST段抬高，QRS波增寬。隨著再灌注時間延長，ST段逐漸回落。見圖3。

圖3 小鼠心臟結(jié)扎LAD前后心電圖改變

3 討論

急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)一直以來是威脅人類健康的主要疾病之一，致死及致殘率極高，AMI是其中最常見的類型[9]。盡管近年來我國胸痛中心建設(shè)成績顯著，溶栓、冠脈介入等再灌注治療時間不斷縮短，心肌梗死的救治成功率越來越高，但心肌缺血再灌注帶來的組織損傷和無菌性炎癥依然存在，對其治療靶點和發(fā)病機制的探索越來越引起學(xué)界的關(guān)注[10]。目前，再灌注損傷中的發(fā)病機制研究主要通過羊、豬、兔、大鼠等動物模型來分析。但由于基因敲除小鼠的廣泛應(yīng)用及小鼠成本低，飼養(yǎng)周期短，繁殖力強等優(yōu)點，小鼠被越來越多地應(yīng)用于心肌缺血再灌注損傷的研究。

小鼠體型小，傳統(tǒng)方法建立心肌缺血再灌注模型時，需術(shù)中開胸，并且需要借助呼吸機維持小鼠術(shù)中的呼吸，插管、開胸、拔管和縫合胸壁等過程耗時長，容易造成小鼠死亡。本實驗造模過程中不使用呼吸機，不需要開胸、插管和拔管，節(jié)省了手術(shù)時間，與以往模型建立方法相比[5-6,11]，效率大大提升，小鼠成活率高。本次實驗中，使用該造模方法，小鼠存活率可達90%，缺血再灌注模型造模成功率86.7%。并且該手術(shù)方法操作迅速，心臟顯露時間短，最大程度地減少了手術(shù)所造成的損傷，有助于小鼠術(shù)后的恢復(fù)，能夠減少手術(shù)過程對后續(xù)實驗造成的影響，適合同時建立一批大數(shù)量的小鼠模型進行實驗研究。

該模型中準確、快速結(jié)扎LAD是實驗成功的關(guān)鍵，需要重視以下幾點：① 結(jié)扎部位的選擇。大多數(shù)文獻報道中，結(jié)扎部位通常以左心耳下緣為標志，在其下1～2 mm處做結(jié)扎，但較難控制，結(jié)扎部位過高會導(dǎo)致小鼠心律失常，嚴重時會導(dǎo)致小鼠心臟驟停猝死。實驗中，我們借助小動物手術(shù)燈，在左心耳下緣尋找到冠狀動脈左主干分出的LAD和左回旋支分叉處形成的“倒Y型”分叉，結(jié)扎沿心臟長軸走行的LAD可提高模型成功率。② 結(jié)扎線的選擇。實驗中我們嘗試使用5-0、6-0、7-0、8-0、9-0的手術(shù)縫合線對LAD進行結(jié)扎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8-0以上的縫合線在結(jié)扎時極容易造成心臟組織損傷，收緊縫合線時容易使心臟組織斷裂，5-0縫合線結(jié)過大，后期抽線進行再灌注時不易使活結(jié)松開，易將組織一起抽出心臟，造成模型構(gòu)建失敗。③ 前期缺血時間的選擇。大多數(shù)文獻中對心肌缺血再灌注結(jié)扎時間的選擇都在30～120 min內(nèi)[4,11-12]，我們在實驗中，設(shè)立了不同缺血時間對照組，觀察組織染色結(jié)果，最終確立缺血45 min、再灌注24 h適合構(gòu)建小鼠心肌缺血再灌注模型。

綜上，本實驗改進了通過結(jié)扎冠狀動脈建立小鼠心肌缺血再灌注模型的方法，操作過程中，不需要借助呼吸機，胸腔顯露面積小、時間短，心電圖和組織染色等方法判斷模型建立成功。同時，改進后的手術(shù)造模時間短，因此可用于快速建立批量模型做大樣本量研究。