新城疫抗體測定中紅細(xì)胞濃度對結(jié)果的影響

傅規(guī)玉

（邵陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系 422004）

新城疫是由新城疫病毒引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血為特征。具有很高的發(fā)病率和病死率，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病[1]。OIE 將其列為A 類疫病。我國將其列為一類動物疫病。新城疫的有效控制關(guān)鍵在于免疫接種和早期檢測，準(zhǔn)確檢測是防控雞新城疫的重要環(huán)節(jié)。而雞新城疫抗體水平檢測方法就是血凝和血凝抑制（HA 與HI）試驗[2]。在血凝和血凝抑制（HA 與HI）試驗中，用的指示劑就是1%紅細(xì)胞，本實驗主要研究1%紅細(xì)胞濃度對雞血清中新城疫抗體水平測定結(jié)果的影響。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

主要器材或設(shè)備，見表1。

1.1.2 主要試劑

主要試劑參見表2。

1.1.3 待測樣品

1 號2 號樣品為雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；

3 號4 號5 號6 號樣品為雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清做2 倍稀釋；

7 號8 號9 號10 號樣品為雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清做4 倍稀釋。

1.2 方法

1.2.1 紅細(xì)胞的配置分為3 組

第一組：取1.5ml 的3.8%檸檬酸鈉到一次性注射器中，健康公雞靜脈采血6ml，將抗凝血分裝到3 個離心管中，2500r/min 離心5min，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)以上過程兩次，用生理鹽水分別配成1%紅細(xì)胞懸液A，1.2%紅細(xì)胞懸液B，0.8%紅細(xì)胞懸液C。

第二組：取1.5ml 的3.8%檸檬酸鈉到一次性注射器中，健康公雞翅下靜脈采血6ml，將抗凝血分裝到3 個離心管中，用生理鹽水洗滌3 次。(1) 第一管每次以2500r/min 離心5min，洗滌3 次后用生理鹽水配成1%紅細(xì)胞懸液A1。(2) 第二管每次以2500r/min 第一次離心5min，第二次離心5min，第三次離心8min，洗滌3 次后用生理鹽水配成1%紅細(xì)胞懸液A2。(3)第三管以2500r/min 三次都離心8min，洗滌3 次后用生理鹽水配成1%紅細(xì)胞懸液A3。

表1 主要器材或設(shè)備表

表2 主要試劑表

第三組：選2 只不同的公雞，公雞J1 是第一次被采雞血，公雞J2 是被多次采過雞血。分別取0.5ml 的3.8%檸檬酸鈉到一次性注射器中，(1) 在公雞J1 翅下靜脈采血2ml，將抗凝血裝到1 個離心管中。將離心管中的血液經(jīng)2500r/min 離心5min再配成1%紅細(xì)胞懸液A3。（2）在公雞J2 翅下靜脈采血2ml，將抗凝血分裝到1 個離心管中。將離心管中的血液經(jīng)2500r/min離心5min 再配成1%紅細(xì)胞懸液A4。

1.2.2 試驗方法和判定標(biāo)準(zhǔn)

按照GB/T16550—2008 采用血凝和血凝抑制試驗檢測的操作方法進(jìn)行規(guī)范操作，個體HI 價＞1：16 (即41og2) 為免疫合格，群體免疫效價≥70 為合格。

2 試驗結(jié)果

參見表 3～5。

表3 第一組試驗結(jié)果

表4 第二組試驗結(jié)果

表5 第三組試驗結(jié)果

3 討論

理論上四單位抗原配制的濃度跟著紅細(xì)胞走的。紅細(xì)胞配得濃，四單位抗原相應(yīng)會濃，紅細(xì)胞配得稀，四單位抗原相應(yīng)會稀。而在此種情況下做出來的HI 試驗結(jié)果，同樣的血清樣品前者的滴度要低一點，后者高一些。但濃度相差多少會顯示在結(jié)果上，這就是試驗的意義。

（1）血凝和血凝抑制試驗中樣品血清沒有變化，血凝抗原及陽性血清都相同，在組1 中，雞紅細(xì)胞濃度不同。在以1%、1.2%、0.8%雞紅細(xì)胞作為指示劑的HA 試驗檢測下，四單位抗原配制濃度是不一樣的。A 是128 倍稀釋，B 是64 倍稀釋，C是256 倍稀釋，在這種情況下檢測出來的樣品也會隨著變化，顯然，同樣的配置方法下，1%紅細(xì)胞濃度相差0.2%，造成血凝和血凝抑制結(jié)果出現(xiàn)差距。

（2）相同的轉(zhuǎn)速、不同的離心時間洗滌紅細(xì)胞，制備的紅細(xì)胞懸液中所含的紅細(xì)胞數(shù)目不同，3 次離心時間越長，血細(xì)胞壓的越緊實，1%的紅細(xì)胞實際濃度越高。應(yīng)該是A3＞A2＞A1，但三者的濃度相差不大，在血凝結(jié)果和血凝抑制結(jié)果無差異。

（3）采不同公雞血制備的1%紅細(xì)胞A4、A5 在血凝和血凝抑制結(jié)果上出現(xiàn)+的差異，說明A4、A5 的紅細(xì)胞實際濃度有差異，A5 的雞血來源公雞J2，J2 是被多次采過血，已經(jīng)貧血，導(dǎo)致A5 的實際濃度偏低，偏低到引起血凝和血凝抑制結(jié)果出現(xiàn)+1 的差距。

4 總結(jié)

（1）明確1%紅細(xì)胞濃度在較大范圍內(nèi)變動，如實際濃度偏高或降低0.2%會導(dǎo)致血凝和血凝抑制結(jié)果出現(xiàn)差距。

（2）試驗要嚴(yán)格按照GB/T16550-1996 操作，在洗滌雞紅細(xì)胞時要選擇適宜的轉(zhuǎn)速和離心時間，2500r/min 的速度離心在新城疫抗體水平測定競賽中第 1、2 次 3min，第 3 次 5min 為宜，可節(jié)約時間。

（3）在技能競賽培訓(xùn)中，同一只雞不要連續(xù)采血超過兩次，以免影響試驗結(jié)果。

（4）加入1%紅細(xì)胞懸液時應(yīng)先將其充分搖勻，以免每孔中加入的紅細(xì)胞懸液濃度不同造成差異。