FK409類NO供體型他汀衍生物合成及活性評價

陳宇瑛 薛雨 艾林 曾其煬

(1 抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，四川抗菌素工業研究所，成都大學，成都 610052；2 四川抗菌素工業研究所金華分所，金華 321000；3 浙江海森藥業股份有限公司，金華 322104)

當前，心腦血管疾病已成為危害人類健康的頭號大敵，其病理基礎是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)，而脂肪代謝素亂、高脂血癥以及高血壓等正是AS形成和病變過程的決定性因素。具有強效調脂作用的他汀類藥物在心腦血管疾病的預防及治療中發揮著舉足輕重的作用。

20世紀90年代以來，由于一氧化氮(NO)在醫學方面所顯示的巨大潛力而逐漸成為醫藥研究和生命科學的熱點和前沿之一，為新藥的發現開辟了一條新途徑。

NO作為信使物質和效應分子，在心血管、神經及免疫等系統中發揮著極其重要的作用，如舒張血管平滑肌、抑制血小板黏附和聚集、抑制血管平滑肌的增生和遷移、抗炎、抗氧化等作用。21世紀以來，有關NO的研究可謂方興未艾，其發展趨勢也從單純的基礎研究逐漸向應用方面轉化。從最早研究的有機硝酸酯類NO供體以來，迄今為止有數十類NO供體被研發出來，并廣泛用于各種生物學研究，按其結構分類主要有以下幾類：有機硝酸酯類、亞硝基硫醇類、呋咱氮氧類、偶氮鎓二醇鹽類、N-芳基-N'-羥基胍類、亞硝胺類、金屬卟啉配合物類、無機亞硝酸鹽類、FK409衍生物類等[1-2]

心腦血管疾病諸如AS、心肌梗塞等常因內皮功能的損傷，使得體內NO的釋放量降低。采用偶聯得到NO供體型他汀類藥物有望通過引入外源性NO來彌補內皮細胞釋放NO的不足，從而在發揮他汀類藥物降血脂作用的同時，能夠發揮協同作用，增強藥理活性，起到前藥性質的作用。

本研究選擇的FK409類NO供體，目前在國內未見相關研究報道。該類供體是在20世紀90年代前后，由日本大阪藤澤藥業株式會社(Fujisawa harmaceutical Co Ltd.Osaka Factory in Japan)研究開發[3]。

FK409化學名為(E)-4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-己酰胺，結構如圖1。文獻報道顯示[1-4]，FK409代謝分解的同時，通過釋放NO，在體外表現出良好的舒張血管、抗血小板聚集作用。FK409類似物結構通式如圖2，其中X可為O、N、S，R1、R2和R3為取代基團，FK409類似物結構中需含有硝基、烯鍵、肟基3個參與活性物質釋放的官能團，通過增長主鏈長度、改變取代基類型而得到的一系列FK409衍生物。

FK409類似物釋放NO的限速步驟[1,7]是硝基α位質子被奪去，這主要取決于兩個因素：一是α-H酸性的大??；二是質子旁空間位阻的大小。如具有給電子效應的基團如烷氧基或烴基，作為的取代R1、R2，會使硝基α-H酸性減小，可降低NO的釋放速率；用大位阻基團如異丙基、叔丁基取代R1、R2，或者R1和R2連接成環狀，增加α-H空間位阻，從而使其不易被奪走，也可達到緩慢釋放NO的目的；以上兩方面的結構修飾都可增長FK409類似物在體內的半衰期，從而有望延長該潛在藥物的作用時間。

圖1 FK409的結構Fig.1 The structure of FK409

圖2 FK409類似物結構通式Fig.2 The structure of FK409 analogues

R3取代基選擇電負性較強的或空間位阻較大的基團來修飾，也一定程度對該類供體化合物釋放NO的速率具有影響，但相比R1和R2的取代對其釋放NO的影響要弱的多。R3位結構修飾的價值在于選擇一些具有藥理活性的化合物來取代，在保證原有藥物藥效的基礎上，通過FK409類似物釋放NO來增強或輔助原有藥物的藥理活性。

他汀類藥物即羥甲基戊二酰單酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑類藥物，能夠強效抑制HMGCoA還原酶的活性，降低總膽固醇和低密度脂蛋白的含量，具有調脂作用強、安全性高、毒副作用小的特點，是目前臨床應用最廣泛、療效最好的調脂類藥物。

通過成酯或酰胺的形式將FK409類NO供體的R3端與他汀類藥物進行拼接，可以得到一類具有前藥性質的化合物，通過體內酶的作用，分別代謝水解成各自成分，有望在發揮他汀類藥物調脂及非調脂藥理作用的基礎上，利用FK409類NO供體釋放一定量的NO來增強他汀類藥物的藥理活性，諸如舒張血管、抗炎、抗氧化等作用。

1 設計與合成

1.1 FK409類NO供體型他汀衍生物的設計

在上述討論的基礎上，設計了以下3種FK409類NO供體衍生物M、P和M'，如圖3所示，R3基團選擇4-氯丁酰氯作為他汀與供體的連接鏈，當X為O時，R1為甲基、R2為乙基定義為M供體；R1為正丙基、R2為乙基定義為P供體；當X為N時，R1為甲基、R2為乙基定義為M'供體。通過R1基團大小的不同以及X電負性的差異，來控制硝基α-H的酸性，從而考查R1基團大小與NO釋放活性的關系。

本文選用阿托伐他汀(Ato)、匹伐他汀(Pita)及瑞舒伐他汀(Rosu)3種他汀藥物，通過與供體M、P偶聯設計以下6個目標物。其中，目標物M-Ato、M-Pita和M-Rosu是M供體分別與上述3種他汀藥物通過中間連接鏈4-氯丁酰氯偶聯得到的FK409類NO供體型他汀衍生物，目標物P-Ato、P-Pita和P-Rosu是P供體分別與上述3種他汀藥物通過中間連接鏈4-氯丁酰氯偶聯得到的FK409類NO供體型他汀衍生物，各目標物結構如圖4所示。

1.2 FK409類NO供體型他汀衍生物的合成設計

當X為O時，即M和P兩種NO供體型他汀目標化合物的合成方法如圖5所示。

圖3 設計的FK409類3種NO供體衍生物Fig.3 Design three types of FK409 NO donor derivatives

圖4 設計的FK409類NO供體型他汀目標化合物Fig.4 Design FK409 NO donor target compounds for statins

以購買得到的兩類烯醛即(E)-2-乙基-2-丁烯醛和(E)-2-乙基-2-己烯醛為原料，按文獻報道方法[1,3,4,8]，在氫化鈉強堿作用下，將烯醛與磷?；宜崛阴ネㄟ^Wittig-Horner烯化反應合成得到烯化產物1；再以乙醚為溶劑，氫化鋰鋁為還原劑，還原反應得中間體2。

中間體2在堿性條件下與中間連接鏈4-氯丁酰氯發生取代反應得氯代物3；然后他汀類化合物以鹽的形式與氯代物3在碘化鉀催化作用下生成化合物4；最后，通過硝化-亞硝化[8-9]反應生成目標產物5。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

Agilent 1100LC/MSD質譜儀(美國Agilent公司)；INOVA400高分辨超導核磁共振儀(Unity)；旋轉蒸發儀(Rotavapor, R-114)；WRS-1A數字熔點儀(上海物理光學儀器廠)；81-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)。所用原料中間體購自Astatech及TCI試劑公司；所用試劑購自成都科龍化工試劑廠，均為分析純或化學純；反應溶劑四氫呋喃和乙醚均作無水處理。

2.2 FK409類NO供體的制備

2.2.1 (E,E)-4-乙基-2,4-二烯-己酸乙酯(M1)的合成[3]

冰浴、氮氣保護下，向150mL的無水THF溶液中加入60%的NaH(4.80g, 120mmol)，攪拌均勻，再向里逐滴加入磷?；宜崛阴?20.16g, 90mmol)、(E)-2-乙基-2-烯-丁醛(5.00g, 51.00mmol)、20mL無水THF的混合溶液，攪拌15min后，撤出冰浴，室溫條件下攪拌4.5h。反應液傾入冰水中，用乙酸乙酯萃取，有機相用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/正己烷=1/30)得5.00g無色具有酯香味油狀物(理論量為8.58g，收率為58.30%)。

2.2.2 (E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-己醇(M2)的合成[3]

圖5 M和P類NO供體型他汀衍生物合成路線Fig.5 The synthesis route of M and P-type NO donor for statin derivatives

室溫、避光條件下，向加入氫化鋰鋁(0.74g, 19.52mmol)的無水乙醚混懸液中，逐滴加入(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-己酸乙酯(5.00g, 29.76mmol)的乙醚溶液，攪拌2h后，TLC顯示仍有原料存在，故又補加了約0.40g氫化鋰鋁，攪拌3h后處理。用乙酸乙酯淬滅反應，過濾，有機層用無水硫酸鎂干燥，濃縮得粗品，采用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/4)得2.71g無色透明油狀物。

2.2.3 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-氯-丁酸己酯(M3)的合成[3]

冰浴中，向(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-己醇(2.87g, 22.78mol)、三乙胺100mL、二氯甲烷150mL的混合液中，滴加4-氯-丁酰氯(6.80g, 48.20mmol)，冰浴攪拌4h，反應液用二氯甲烷萃取，二氯甲烷層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/30)，得4.30g無色透明油狀物。ESIMS(m/z)：231.7[M+H]+, C12H19ClO2(MW=230.1)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：6.18(1H,J=15.6Hz, d)；5.68～5.52(2H, m)；4.62(2H,J=6.8Hz, d)；3.60(2H,J=5.1Hz, t)；2.51(2H,J=5.8Hz, t)；2.23(2H,J=6.5Hz, q)；2.13～2.06(2H, m)；1.72(3H,J=14.8Hz, d)；0.99(3H,J=4.2Hz, t)。

2.2.4 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-氯-丁酸己酯(M)的合成[1,3-6]

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸己酯(0.41g, 1.80mmol)、NaNO2(0.74g, 10.70mmol)、甲醇15mL、水10mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(1.22mL, 7mmol)，室溫攪拌30min，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/4)，得0.16g黃色油狀物。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm): 6.00(1H, s)；5.17(1H,J=6.8Hz, q)；4.77(2H, s)；3.61(2H,J=9.2Hz, t)；2.54(2H,J=11.2Hz, t)；2.23～2.08(4H, m)；1.73(3H,J=16Hz, d)；1.07(3H,J=8.7Hz, t)。

2.2.5 (E,E)-4-乙基-2,4-二烯-辛酸乙酯的(P1)合成[3]

氮氣保護、冰浴條件下，向30mL的無水THF溶液中加入60%的NaH(1.20g, 30mmol)，攪拌均勻，再向里逐滴加入磷酰基乙酸三乙酯(4.48g, 20mmol)、(E)-2-乙基-2-烯-己醛(1.50g, 11.90mmol)、10mL無水THF的混合溶液，攪拌15min后，撤出冰浴，室溫條件下攪拌5h。反應液傾入冰水中，用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/30)得0.29g無色具有酯香味油狀物。ESIMS(m/z)：197.1[M+H]+, C12H20O2(MW=196.1)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.17(1H,J=16Hz, d)；5.96(1H,J=7.4Hz, t)；5.84(1H,J=16Hz, d)；4.13(2H,J=8.2Hz, q)；2.25(2H,J=9.6Hz, q)；2.16(2H,J=11.2Hz, q)；1.48～1.38(2H, m)；1.25～1.18(3H, m)；0.98～0.85(6H, m)。

2.2.6 (E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-辛醇(P2)的合成[3]

室溫條件下，向加入氫化鋰鋁(1 8.5 4 m g, 0.49mmol)的無水乙醚混懸液中，逐滴加入(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-辛酸乙酯(0.12g, 0.61mmol)，攪拌2h。用乙酸乙酯淬滅反應，過濾，有機層用無水硫酸鎂干燥，濃縮得粗品，硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/4)得0.07g無色透明油狀物。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：6.05(1H,J=15.6Hz, d)；5.69～5.63(1H, m)；5.36(1H,J=16Hz, t)；4.67(1H,J=16.2Hz, t)；3.99(2H,J=14.6Hz, t)；2.20～2.03(4H, m)；1.40～1.31(2H, m)；0.98～0.81(6H, m)。

2.2.7 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-氯-丁酸辛酯(P3)的合成[1,3]

冰浴、氮氣保護條件下，向(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-辛醇(0.14g, 0.88mmol)、碳酸氫鈉(0.13g, 1.54mmol)、二氯甲烷10mL、水2mL的混合液中，滴加4-氯-丁酰氯(0.18g, 1.30mmol)，攪拌過夜后，pH檢測反應液呈較強酸性，用碳酸氫鈉調反應液至中性。反應液用二氯甲烷萃取，二氯甲烷層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用乙酸乙酯/環己烷=1/30的洗脫劑進行硅膠柱層析，得到0.13g無色透明油狀物(理論量為0.23g，收率為55.6%)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：5.93(1H,J=15.6Hz, d)；5.72～5.64(1H, m)；5.26(1H,J=7.4Hz, t)；4.11(2H,J=7.0Hz, t)；3.60(2H,J=3.0Hz, t)；2.54～2.20(6H, m)；2.15～2.05(4H, m)；1.06～0.99(6H, m)。

2.2.8 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-氯-丁酸辛酯(P)的合成[1,3]

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸辛酯(0.77g, 3.00mmol)、NaNO2(1.33g, 19.20mmol)、甲醇30mL、水20mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(2mL, 11.52mmol)，室溫攪拌30min，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥、濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/4)，得0.12g黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：357.1[M+Na]+, 373.0[M+K]+, C14H23ClN2O5(MW=334.1)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：6.03(1H, s)；5.01(1H,J=4.4Hz, t)；4.76(2H, s)；3.60(2H,J=6.2Hz, t)；2.53(2H,J=7.0Hz, t)；2.25～2.04(1H, m)；2.22～2.02(4H, m)；1.96～1.82(1H, m)；1.42～1.24(2H, m)；1.06(3H,J=5.7Hz, t)；0.98(3H,J=6.4Hz, t)。

2.3 FK409類NO供體型他汀衍生物的合成

2.3.1 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸己酯(M3-Ato)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸己酯(0.21g, 0.91mmol)、阿托伐他汀鈣(1.16g, 1.00mmol)、25mL的DMF混合，加入適量催化劑KI，室溫攪拌30h，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/1)，得64.40mg油狀物。ESI-MS(m/z)：753.3[M+H]+, C45H53FN2O7(MW=752.4)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.20～7.14(9H, m)；7.06(2H,J=8.0Hz, d)；7.02～6.96(3H, m)；6.87(1H, s)；6.18(1H,J=16.0Hz, d)；5.67～5.53(2H, m)；4.62(2H,J=16.0Hz, d)；4.15～4.04(4H, m)；4.00～3.91(1H, m)；3.78～3.68(1H, m)；3.69～3.62(1H, m)；3.61～3.55(1H, m)；2.48～2.36(2H, m)；2.41(2H,J=7.2Hz, t)；2.23(2H,J=7.6Hz, q)；2.05～1.95(2H, m)；1.75～1.60(2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.59-1.42(2H, m)；1.53(6H,J=7.2Hz, d)；0.99(3H,J=7.4Hz, t)。

2.3.2 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(M3-Pita)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸己酯(0.58g, 2.50mmol)、匹伐他汀鈣(2.00g, 2.27mmol)、25mL的DMF混合，加入適量催化劑KI，室溫攪拌30h，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/1)，得0.50g油狀物。ESI-MS(m/z)：616.2[M+H]+, C37H42FNO6(MW=615.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.95(1H,J=8.0Hz, d)；7.60～7.56 (1H, m)；7.35～7.28(2H, m)；7.24～7.13(4H, m)；6.63(1H,J=16.4Hz, d)；6.19(1H,J=15.6Hz, d)；5.68～5.53 (3H, m)；4.63(2H,J=6.4Hz, d)；4.45～4.35(1H, m)；4.19～4.06(1H, m)；4.17(2H,J=6.4Hz, t)；2.49～2.37(2H, m)；2.42(2H,J=3.2Hz, t)；2.24(2H,J=7.6Hz, q)；2.04～1.97 (2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.58～1.29 (2H, m)；1.39～1.26 (1H, m)；1.05～0.95 (4H，m)；0.99 (3H,J=7.6Hz, t)。

2.3.3 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(M3-Rosu)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸己酯(1.15g, 4.90mmol)、瑞舒伐他汀鈉(5.00g, 9.93mmol)、25mL的DMF混合，加入適量催化劑KI，室溫攪拌30h，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/1)，得0.56g油狀物。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.66～7.62(2H, m)；7.09(2H,J=8.6Hz, t)；6.63(1H,J=16Hz, d)；6.19(1H,J=15.6Hz, d)；5.66～5.42(3H, m)；4.62(2H,J=6.8Hz, d)；4.46(1H, s)；4.19～4.15(3H, m)；3.75(1H, s)；3.62(1H, s)；3.57(3H, s)；3.52(3H, s)；3.38～3.34(1H, m)；2.47～2.40(2H, m)；2.42(2H,J=4.8Hz, t)；2.23(2H,J=7.6Hz, q)；2.03～1.97(2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.57～1.42(2H, m)；1.26(6H,J=6.8Hz, d)；0.99(3H,J=7.6Hz, t)。

2.3.4 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸辛酯(P3-Ato)的合成

合成方法參照“2.3.1”項。

2.3.5 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(P3-Pita)的合成

合成方法參照“2.3.2”項。

2.3.6 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(P3-Rosu)的合成

合成方法參照“2.3.3”項。

2.3.7 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸己酯(M-Ato)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R,5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸己酯(0.66g, 0.88mmol)、NaNO2(0.36g, 5.28mmol)、甲醇15mL、水10mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(1.13mL, 6.50mmol)，室溫攪拌30min，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/1)，得104.20mg淺黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：829.9[M+H]+, C45H53FN4O10(MW=828.4)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.27～7.12(9H, m)；7.06(2H,J=8Hz, d)；7.02～6.96(3H, m)；6.87(1H, s)；6.02(1H, s)；5.15(1H,J=6.8Hz, q)；4.75(2H,J=5.2Hz, t)；4.22～4.06(4H, m)；3.98～3.92(1H, m)；3.80～3.65(2H, m)；3.56(2H,J=7.2Hz, t)；2.48～2.36(4H, m)；2.22～2.18(2H, m)；1.98～1.94(2H, m)；1.75～1.60(2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.59～1.42(2H, m)；1.53(6H,J=7.2Hz, d)；1.06(3H,J=7.6Hz, t)。

2.3.8 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(M-Pita)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R,5R,6E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(0.52g, 0.85mmol)、NaNO2(0.35g, 5.10mmol)、甲醇24mL、水9mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(0.68mL, 4.08mmol)，室溫攪拌30min，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/1)，得62.10mg淺黃色油狀物。ESIMS(m/z)：692.2[M+H]+, C37H42FN3O9(MW=691.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.96(1H,J=7.6Hz, d)；7.59(1H,J=7.0Hz, t)；7.36～7.28(2H, m)；7.21～7.13(4H, m)；6.63(1H,J=16.0Hz, d)；6.03(1H, s)；5.57(1H,J=16.0Hz, 6.4Hz, dd)；5.16(1H,J=6.8Hz, q)；4.76(2H,J=5.2Hz, t)；4.40(1H, s)；4.24～4.09(4H, m)；3.82(1H, s)；3.32(1H, s)；2.50～2.24(2H, m)；2.44(2H,J=8.6Hz, t)；2.20(2H,J=1.2Hz, q)；2.05～1.98(2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.64～1.42(2H, m)；1.35～1.24(1H, m)；1.08～0.95(4H, m), 1.07(3H,J=7.2Hz, t)。

2.3.9 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(M-Rosu)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(0.40g, 0.60mmol)、NaNO2(0.50g, 7.20mmol)、甲醇24mL、水9mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(0.96mL, 5.76mmol)，室溫攪拌30min，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/1)，得84.30mg淺黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：752.8[M+H]+, C34H46FN5O11S (MW=751.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.63(2H,J=8.0Hz, t)；7.08(2H,J=8.6Hz, t)；6.62(1H,J=15.6Hz, d)；6.00(1H, s)；5.44(1H,J=17.3Hz, 9.2Hz, dd)；5.17～4.94(3H, m)；4.46(1H, s)；4.19(1H, s)；4.17(2H,J=9.2Hz, t)；3.56(3H, s)；3.51(3H, s)；3.39～3.32(1H, m)；2.54～2.20(6H, m)；2.15～1.95(2H, m)；1.73(3H,J=7.2Hz, d)；1.61～1.44(2H, m)；1.25(6H,J=6.4Hz, d)；1.14～1.02(3H, m)。

2.3.10 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R) -7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸辛酯(P-Ato)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸辛酯(1.60g, 2.05mmol)、NaNO2(0.85g, 12.30mmol)、甲醇30mL、水20mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(1.67mL, 10mmol)，室溫攪拌30min，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/1)，得0.24g淺黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：857.9[M+H]+, C47H57FN4O10(MW=856.4)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.20～7.12(9H, m)；7.06(2H,J=8.0Hz, d)；7.02～6.97(3H, m)；6.87(1H, s)；6.05(1H, s)；5.00(1H,J=6.0Hz, q)；4.74(2H, s)；4.22～4.06(4H, m)；3.98～3.90(1H, m)；3.79～3.66(2H, m)；3.57～3.53(2H, m)；2.46～2.38(2H, m)；2.43(2H,J=8.8Hz, t)；2.29～2.16(3H, m)；1.98～1.90(2H, m)；1.92～1.82(1H, m)；1.73～1.62(2H, m)；1.59～1.42(2H, m)；1.53(6H,J=7.2Hz, d)；1.38(2H, m)；1.05(3H,J=7.6Hz, t)；0.98(3H,J=7.4Hz, t)。

2.3.11 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(P-Pita)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R,5R,6E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(1.40g, 2.18mmol)、NaNO2(0.90g, 13.06mmol)、甲醇30mL、水20mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(1.67mL, 10mmol)，室溫攪拌30min，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/1)，得0.34g淺黃色油狀物。ESIMS(m/z)：720.8[M+H]+, C39H46FN3O9(MW=719.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.96(1H,J=8.4Hz, d)；7.59(1H, s)；7.36～7.28(2H, m)；7.21～7.13(4H, m)；6.63(1H,J=12Hz, d)；6.06(1H, s)；5.57(1H,J=15.8Hz, 6.2Hz, dd)；5.00(1H,J=8.8Hz, q)；4.75(2H, s)；4.40(1H, s)；4.24～4.09(4H, m)；3.82(1H, s)；3.32(1H, s)；2.53～2.24(4H, m)；2.30～2.12(3H, m)；2.04～1.94(2H, m)；1.96～1.82(1H, m)；1.64～1.42(2H, m)；1.42～1.24(3H, m)；1.08～0.95(4H, m)；1.07～0.85(6H, m)。

2.3.12 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R,6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(P-Rosu)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R,5R,6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(0.60g, 0.85mmol)、NaNO2(0.35g, 5.11mmol)、甲醇15mL、水10mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(0.84ml, 5.00mmol)，室溫攪拌30min，反應液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和食鹽水洗后，無水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環己烷=1/1)，得38.60mg淺黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：780.8[M+H]+, C36H50FN5O11S (MW=779.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.65(2H,J=8.4Hz, t)；7.09(2H,J=8.6Hz, t)；6.64(1H,J=16Hz, d)；6.03(1H, s)；5.45(1H,J=7.8Hz, d)；5.01～4.89(1H, m)；4.46(1H, s)；4.40～4.08(3H, m)；3.77～3.58(2H, m)；3.57(3H, s)；3.52(3H, s)；3.40～3.34(1H, m)；2.52～2.39(2H, m)；2.46(2H,J=13.2Hz, t)；2.43～2.41(2H, m)；2.40～2.16(2H, m)；2.05～1.98(1H, m)；1.82～1.74(1H, m)；1.61～1.44(2H, m)；1.39～1.30(2H, m)；1.26(6H,J=6.4Hz, d)；1.15～0.92(6H, m)。

3 NO釋放活性測定

目標化合物通過亞硝酸鹽-硝酸鹽法進行體外NO釋放活性測定。有機硝酸酯類NO供體需在含巰基化合物如L-半胱氨酸或谷胱甘肽等的參與下才能釋放NO，因其釋放NO的機制是在助釋劑的作用下通過巰基對硝酸酯基團的N原子進行親核進攻，從而釋放NO[9]。與有機硝酸酯類或其他類NO供體不同，根據以上討論的FK409類供體NO釋放機制，目標化合物的NO釋放無需在含巰基化合物的參與下進行，僅需在弱堿性條件即可。釋放出的NO化學性質活潑，在水溶液或富氧條件下很容易被氧化成亞硝酸鹽，再發生重氮化、偶合反應產生玫瑰紅色的化合物，該偶聯產物在548nm波長處具有特定強吸收峰，根據測定的紫外吸收數據，從而間接計算出目標化合物釋放NO的量。

分別測試6 個目標化合物，測試濃度為0.10mmol/L，將測得紫外吸收數據，通過標準溶液回歸方程換算成NO濃度見表1。

從表1可以看出FK409類NO供體型他汀衍生物釋放NO具有一定的梯度，在1～5h內隨時間的增長，釋放NO的總量在增加。選取釋放NO量適當的目標物M-Rosu作圖(圖6)。

以6個目標化合物在6h內釋放NO的總量計算釋放百分率見表2。從表2可看出化合物M-Pita釋放NO百分率比其他衍生物要高，能在較長時間內仍具有NO釋放活性。

另外，通過以上FK409類NO供體型他汀衍生物NO釋放結果的比較，R3位置的結構修飾對NO的釋放發揮著至關重要的作用。

該類NO供體型他汀衍生物雖然釋放NO百分率有差異，但在較長時間內均具有釋放活性，這種特性對于延長潛在藥物在體內代謝的半衰期，延長作用時間具有重要的研究意義。

NO釋放機制[1,8,10]：本文合成的6個目標化合物，其NO供體部分在體內釋放NO具有明確的機制，該類供體結構中，因硝基的強吸電子誘導效應而使α-H具有一定的酸性，在堿性(RS-, OH-)條件下α-H容易被奪去，生成一對互變異構體，再經過生物轉化釋放NO(圖7)。根據以上機制，該類供體化合物設計主要是增大R1和R2位的空間位阻來控制α-H的酸性，從而延長供體在體內的半衰期，即延長作用時間。FK409類似物的構效關系決定了該類供體釋放NO具有一定可控性。

表1 不同時間內(min)釋放的NO的濃度Tab.1 The concentration of the NO which target chemicals release in different time

圖6 化合物M-Rosu(7)釋放NO總量隨時間變化圖Fig.6 The figure that the total amount of NO released by the compound M-Rosu (7) change over time

表2 目標化合物體外釋放NO百分率Tab.2 The percentage of NO released by the target compound in vitro

4 結論

本文選擇FK409類NO供體，設計其與他汀類降血脂藥物(阿托伐他汀、匹伐他汀和瑞舒伐他汀)進行偶聯的6個全新的NO供體型他汀類衍生物，并成功合成得到6個目標產物，部分中間體及目標產物的結構經ESI-MS、1H NMR確證。體外NO釋放活性評價結果表明：目標化合物具有良好的NO釋放活性，通過結構修飾可使其NO釋放具有一定的可控性，為進一步研究新型NO供體型他汀藥物提供參考。

圖7 NO釋放機制Fig.7 The mechanism of NO release