銅綠假單胞菌III型分泌系統(tǒng)相關毒力基因在抗菌藥物中表達差異的研究

方雪瑤 胡龍華 杭亞平 胡曉彥 俞鳳 陳艷慧 鐘橋石

(南昌大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西省檢驗醫(yī)學重點實驗室，南昌 330006)

銅綠假單胞菌是臨床常見條件致病菌之一，常引起免疫低下患者的各種急慢性感染。研究表明，III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system, T3SS)在銅綠假單胞菌的感染及致病過程中發(fā)揮重要作用[1]，其中效應蛋白ExoS和ExoU為主的毒力蛋白表達可導致肺泡上皮細胞、巨噬細胞和成纖維細胞的凋亡，加重炎癥程度，最終導致感染難以控制[2-3]。本文將重點探討T3SS毒力基因exoS和exoU在銅綠假單胞菌中表達差異與細菌耐藥性之間的關系，以期為臨床選擇合適的抗感染治療方案及預后評估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2017年1月—2017年12月南昌大學第二附屬醫(yī)院住院患者送檢的72株臨床標本，其中痰液標本40株，血液標本10株，膿液標本6株，尿液標本4株，傷口分泌物標本4株，穿刺液標本3株，引流液標本3株，膽汁標本2株，均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第4版)的標準驗收標本，剔除重復及不合格標本。陽性質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，購自溫州康泰生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定與藥敏試驗

采用Vitek2 Compact全自動微生物鑒定儀(Mérieux公司)進行菌株鑒定；藥敏試驗根據(jù)美國臨床實驗室標準委員會(The Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2017版標準進行判讀藥敏結果。

1.2.2 提取菌株DNA

煮沸法；接種單菌落于LB平板，37℃培養(yǎng)24h，1.5mL EP管內(nèi)加300μL無菌雙蒸水，用接種環(huán)取純分離的細菌半環(huán)到一環(huán)，加入EP管，混勻，100℃煮沸10min，12000r/min離心10min，分離上清即為細菌總DNA，置于-20℃冰箱備用 。

1.2.3 PCR法檢測

T3SS特征片段popB基因及毒力基因exoS、exoU。引物設計參照文獻[4-5]，引物由上海生工生物工程公司合成，DNA聚合酶、DNA marker均于北京天根生化公司訂購(引物序列見表1)。PCR 條件設置：95℃ 10min；95℃ 30s、60℃ 30s和72℃ 30s共35個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物取2μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后用凝膠成像儀觀察結果，PCR產(chǎn)物送杭州擎科梓熙生物技術有限公司進行測序后在Blast中比對。

1.3 統(tǒng)計學處理

以 SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 T3SS毒力基因檢測

檢測72株臨床分離的銅綠假單胞菌株毒力基因，發(fā)現(xiàn)T3SS標志性片段popB的陽性株為68株，陽性率為94.44%(68/72)；攜帶銅綠假單胞菌分為exoS+/exoU-、exoS-/exoU+、exoS+/exoU+和exoS-/exoU- 4種類型組合，檢出率分別為56.94%(41/72)、26.39%(19/72)、4.17%(3/72)和12.50%(9/72)。其中3株細菌(4.17%)同時攜帶exoS和exoU毒力基因，9株細菌(12.50%)exoS和exoU均未檢出exoS、exoU毒力基因(包含4株T3SS陰性的銅綠假單胞菌)。

2.2 exoS和exoU基因的分布特征

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR Primer sequences

分離的72株銅綠假單胞菌標本來源以痰液(占55.56%)、血液(占13.89%)及膿液(占8.33%)標本為主(剔除重復菌株)。各種類型標本中均以exoS+/exoU-基因組合檢出率最高，在痰液、血液和膿液中檢出率分別為57.50%(23/40)、70.00%(7/10)和66.67%(4/6)，詳見表2。

表2 銅綠假單胞菌popB基因及毒力基因exoS和exoU的分布特征Tab.2 Distribution characteristics of popB, exoS and exoU in Pseudomonas aeruginosa

2.3 exoS和exoU基因與耐藥性

攜帶exoU基因銅綠假單胞菌顯示出對亞胺培南、氨曲南、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物較高耐藥率，其中對亞胺培南、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；攜帶exoU基因的總菌株為22株，其對亞胺培南、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、左氧氟沙星及環(huán)丙沙星的耐藥率分別為45.45%、45.45%、50.00%、50.00%、40.91%和40.91%；攜帶exoS基因的總菌株為44株，其對以上藥物的耐藥率分別為4.55%、6.82%、4.55%、18.18%、11.36%和18.18%；攜帶exoS基因銅綠假單胞菌對氨曲南較高的耐藥性，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見表3。

3 討論

T3SS是銅綠假單胞菌為適應外界環(huán)境、保護自身生存進化而形成[6]，其能通過分泌exoS、exoU、exoT和exoY等效應蛋白發(fā)揮毒性作用；其中exoU是一種具有磷脂酶和腺苷酸環(huán)化酶活性的細胞毒素，可以導致不可逆的細胞膜損傷以及快速的壞死，是T3SS危害最大、最具破壞性的效應蛋白[7-8]；exoS則具有腺苷二磷酸核糖轉移酶活性，可抑制宿主細胞吞噬作用、導致細胞凋亡等作用，其毒力效應僅次于exoU[9]。因此以效應蛋白exoS和exoU為主的毒力蛋白表達，可直接影響感染患者的病情進展及預后。本研究通過檢測T3SS毒力基因exoS和exoU的表達情況，分析毒力基因與常用抗菌藥物耐藥性的關系，以期為感染此類細菌患者的治療及預后評估提供可靠依據(jù)。

表3 攜帶毒力基因exoS、exoU銅綠假單胞菌與抗菌藥物耐藥性Tab.3 Correlation between virulence genes exoS, exoU and antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa

研究表明，幾乎所有從臨床或環(huán)境中分離的銅綠假單胞菌株都能檢測到T3SS，但不同來源的標本常存在不同基因型組合[5]。本研究分離的72株銅綠假單胞菌中，T3SS分泌系統(tǒng)的攜帶率高達94.44%，其中exoS+/exoU-、exoS-/exoU+、exoS+/exoU+和exoS-/exoU-這4種基因型檢出率分別為56.94%、26.39%、4.17%和12.50%。由于患者地域、患病類型、標本來源等的不同，與國內(nèi)報道的exoS、exoU基因型檢出率存在較大差異[10]。本研究所收集的各類型標本中均以exoS+/exoU-組合型檢出率最高，顯示銅綠假單胞菌表達毒力基因無明顯感染部位差異。國外研究顯示，exoU毒力基因所發(fā)揮的致死性細胞毒性可引起組織吞噬細胞損傷，這不僅使銅綠假單胞菌在病灶中持續(xù)存在，而且還會促進其他條件致病菌的雙重感染，導致患者感染加重和預后不良[11]。

細菌毒力基因常與其耐藥性的產(chǎn)生具有一定相關性，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶exoU基因銅綠假單胞菌對亞胺培南和氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率(均＞40%)顯著高于exoS基因(均＜20%)，與Wong-Beringer等[12]的研究結果一致，但目前對其耐藥機制尚不完全清楚；還發(fā)現(xiàn)，攜帶exoU基因銅綠假單胞菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥率顯著高于exoS基因，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。值得注意的是，目前國內(nèi)外尚無相關報道攜帶exoU基因銅綠假單胞菌與氨基糖苷類耐藥性具有正相關性，這可能是由于各地區(qū)抗菌藥物的使用習慣不同致使臨床致病菌所面臨的抗菌藥物選擇壓力不同，導致致病菌耐藥基因發(fā)生相應適應性的變異，具體耐藥機制需要進一步探討研究。此外，藥敏結果顯示攜帶exoS和exoU毒力基因銅綠假單胞菌對頭孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦的耐藥率均較低(＜20%)，表明此類藥物可以作為本地區(qū)銅綠假單胞菌感染經(jīng)驗治療優(yōu)先考慮藥物。

銅綠假單胞菌對多種抗生素天然耐藥，易形成生物膜，并且常多種耐藥機制共存，導致臨床治療無藥可選。其中氨基糖苷類和喹諾酮類藥物常用于治療碳青霉烯類耐藥的銅綠假單胞菌，然而我們發(fā)現(xiàn)攜帶exoU基因銅綠假單胞菌對氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性更高，使得臨床治療面臨更大的挑戰(zhàn)。因此進一步對銅綠假單胞菌T3SS致病性的研究及有關新穎抑制劑的開發(fā)具有重要意義，國內(nèi)外現(xiàn)階段在其抑制劑的研發(fā)上已取得較大進展，但對其真正作用靶點的確定仍為難題。本研究揭示銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)exoS和exoU毒力基因在抗菌藥物中表達差異性，將為臨床治療感染此類細菌患者提供可靠依據(jù)。