基于深孔板培養(yǎng)高通量篩選rakicidin B1高產(chǎn)菌的研究

周劍 江紅 林風(fēng)

(福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350007)

Rakicidins是微生物來源的15元環(huán)脂肽化合物，其結(jié)構(gòu)中含1個(gè)極為罕見的4-氨基-2,4-戊二烯酸辛酰胺[1-2]。目前已分離的rakicidins類化合物主要含有rakicidin A、 A1、B、B1及H、I、J等[3-6]。研究表明rakicidins類化合物具有廣譜抗腫瘤細(xì)胞、乏氧選擇性抗腫瘤細(xì)胞、抗臨床致病艱難梭菌及抗耐萬古霉素腸球菌等活性[7-9]。現(xiàn)有研究中關(guān)于rakicidins類化合物的微生物發(fā)酵的研究報(bào)道較少，Mcbrien等[1]報(bào)道了rakicidins類化合物的搖瓶發(fā)酵及分離純化工藝，其發(fā)酵液中的主要組分多為rakicidin A，rakicidin B的含量比較低。化合物rakicidin B1是本課題組首先發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有較好的生理活性[3]。如果要開發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)海洋來源的微生物藥物，就必須篩選出rakicidin B1的高產(chǎn)菌株。

近年來，常壓室溫等離子誘變技術(shù)(ARTP)在微生物菌種選育方面應(yīng)用越來越廣泛，并己成功運(yùn)用到細(xì)菌、放線菌、真菌、微藻等微生物的菌種遺傳改良方面[10-13]。ARTP誘變技術(shù)對(duì)微生物DNA突變譜系明顯高于其它理化誘變方法[14]。核糖體工程是指利用慶大霉素、鏈霉素、利福平等抗生素與微生物核糖體或RNA聚合酶的相互作用，向微生物核糖體組分引入特定類型突變，調(diào)控代謝系統(tǒng)，從而影響次級(jí)代謝產(chǎn)物表達(dá)[15-16]。利用核糖體工程可以有助于快速、簡(jiǎn)便地篩選出對(duì)應(yīng)的突變株，進(jìn)而改進(jìn)其環(huán)境耐受性，提高其次級(jí)代謝的產(chǎn)量或產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物[17]。高通量篩選技術(shù)具有高效、自動(dòng)、微量、微型、低成本等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于工業(yè)微生生物菌種選育、酶活性優(yōu)化、藥理活性篩選等工作中，極大地提高工作效率[18-20]。

本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的海洋小單孢菌FIM02-523進(jìn)行ARTP誘變處理，經(jīng)慶大霉素抗性篩選及深孔板高通量篩選獲得rakicidin B1高產(chǎn)菌株。

1 材料和方法

1.1 主要儀器設(shè)備

S30K型pH儀(瑞士Mettler公司)；INNOVA-5000型雙層搖床(New Brunswick Scientific)；Agilent 1260 DAD高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；24/96深孔板(荷蘭EnzyScreen BV公司)；三明治蓋板(荷蘭EnzyScreen BV公司)；接種器(荷蘭EnzyScreen BV公司)；8通道電動(dòng)移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

海洋小單孢菌FIM02523本課題組篩選獲得并保藏。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見參考文獻(xiàn)[7]。

1.4 分析方法

發(fā)酵液中rakicidin B1效價(jià)的測(cè)定按文獻(xiàn)[21]進(jìn)行。

1.5 菌種誘變與篩選

1.5.1 最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)的確定

取適量濃度為106～107CFU/mL的出發(fā)菌株孢子懸液分別涂布于含不同濃度慶大霉素的分離平板中，以不含抗生素平板為對(duì)照；于30℃恒溫培養(yǎng)10～15d左右，觀察菌落生長(zhǎng)情況。以肉眼能夠觀察到未長(zhǎng)菌落的抗生素最小濃度為慶大霉素對(duì)該菌株的MIC。

1.5.2 ARTP誘變

ARTP誘變條件[13]：工作功率120W，氣源為Ar，氣流量10L/min，照射時(shí)間為0、60、120、180、240、360s。誘變后的菌懸液適當(dāng)稀釋并涂布于分離平板，于30℃恒溫培養(yǎng)15d左右，用于致死率計(jì)算和菌種篩選。

1.5.3 高通量深孔板篩選過程

將經(jīng)過ARTP誘變處理的海洋小單孢菌孢子懸液適當(dāng)稀釋，分別涂布到的分離平板(含最小抑菌濃度)，30℃恒溫培養(yǎng)15d。將分離平板上長(zhǎng)好的單菌落挑種到24深孔板中培養(yǎng)(每孔裝有2.0mL固體培養(yǎng)基)，每塊板可以培養(yǎng)24個(gè)菌落。

培養(yǎng)好的新鮮斜面板用孔板接種器轉(zhuǎn)接至對(duì)應(yīng)的24深孔板(種子板)，蓋上三明治蓋板后置于30℃、250r/min、濕度65%左右的搖床振蕩培養(yǎng)，同時(shí)斜面板存于4℃冰箱待用；種子板培養(yǎng)48h后按5.0%的接種量移種到發(fā)酵板(裝有2.5mL發(fā)酵培養(yǎng)基)上，于30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)4d左右。

培養(yǎng)好的發(fā)酵液按1:3的體積比例加入甲醇混勻并超聲20min后離心。取上清液用于HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中rakicidin B1效價(jià)。每塊發(fā)酵板挑選效價(jià)最高的1～2株菌株傳二代斜面用于復(fù)篩。

1.5.4 菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將篩選出的高產(chǎn)突變株用斜面連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)定rakicidin B1的產(chǎn)量，考察高產(chǎn)突變株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 深孔板發(fā)酵方法建立

取新鮮培養(yǎng)的種子液按5.0%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后用八通道電動(dòng)移液槍吸取不同體積發(fā)酵液分裝到24深孔板、96深孔板中，其中24深孔板裝液量為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL；96深孔板裝液量為0.25、0.5、0.75和1.0mL；每個(gè)裝量體積設(shè)置8個(gè)平行樣；同時(shí)設(shè)置搖瓶對(duì)照，裝液量分別為40、60、80、100、和120mL，每組5瓶。接種后于30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)4d。

由表1可以看出24深孔板發(fā)酵數(shù)據(jù)結(jié)果比較接近搖瓶，且數(shù)據(jù)變異系數(shù)較低，說明24深孔板可以用于替代搖瓶篩選。裝液量2.5mL效價(jià)和變異系數(shù)均比較理想。96深孔板裝液量0.25mL時(shí)部分效價(jià)接近搖瓶，但是波動(dòng)較大，而且部分孔板出現(xiàn)結(jié)球現(xiàn)象，可能由于裝液體積太少隨著培養(yǎng)時(shí)間增加液體揮發(fā)以及微量接種無法保證接種量的一致性等因素影響，導(dǎo)致結(jié)果不理想。當(dāng)96孔板裝液量超過0.5mL后可能溶氧不足導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)不良，產(chǎn)量較低。綜合考慮采用24深孔板發(fā)酵，裝液量為2.5mL。

表1 不同裝液量體積對(duì)rakicidin B1發(fā)酵單位的影響Tab.1 The effect of different volume of fermentation on the yield of rakicidin B1

以24深孔板裝量2.5mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，考察不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)深孔板發(fā)酵的影響，對(duì)照為常規(guī)搖瓶發(fā)酵對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)速250r/min，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明搖床轉(zhuǎn)速在250～300r/min之間rakicidin B1發(fā)酵效價(jià)最高，在后面的篩選實(shí)驗(yàn)過程中可以選擇250r/min的轉(zhuǎn)速作為發(fā)酵培養(yǎng)條件。

2.2 慶大霉素抑菌濃度(MIC)的確定

取濃度為106～107CFU/mL的孢子懸浮液0.1mL分別涂布于含不同濃度慶大霉素的分離平板中，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，平板培養(yǎng)基中添加慶大霉素后，菌落生長(zhǎng)變慢，菌落較小。隨著慶大霉素濃度的增加，菌株在分離平板上的單菌落逐漸減少，當(dāng)慶大霉素濃度達(dá)到0.4μg/mL時(shí)，分離平板上無明顯單菌落形成，此濃度即為此菌株的MIC。

2.3 ARTP誘變劑量的確定

按照“1.6.2”項(xiàng)方法對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP處理，誘變后的菌懸液按一定倍數(shù)稀釋并涂布于固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d左右，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)繪制致死率曲線，結(jié)果如圖1。ARTP處理的致死率和誘變劑量關(guān)聯(lián)性比較好，隨著誘變時(shí)間的增加致死率也上升。處理時(shí)間為60s時(shí)，致死率為33%左右；處理時(shí)間為180s，致死率達(dá)到77%左右；處理時(shí)間為240s時(shí)，致死率達(dá)到89%左右；處理時(shí)間超過300s時(shí)，致死率接近100%。

表2 不同轉(zhuǎn)速對(duì)24孔板發(fā)酵產(chǎn)rakicidin B1的影響Tab.2 The effect of different rotation speed on the yields of rakicidin B1

表3 不同慶大霉素濃度對(duì)小單孢菌FIM02523生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effect of gentamicin concentration on the growth of strain FIM-02523

綜合考慮致死率曲線變化規(guī)律及慶大霉素抗性選育需要足夠量的菌落數(shù)，在誘變后期試驗(yàn)中采用致死率77%左右的誘變條件，即輻射處理時(shí)間為180s。

2.4 深孔板高通量篩選

按照“1.6.2”項(xiàng)方法對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP輻射處理，處理?xiàng)l件為：離子源功率120kW，氣源為氬氣，氣流量10L/min，按照射時(shí)間180s；處理后的菌懸液采用“1.6.3”項(xiàng)方法進(jìn)行初步篩選。每個(gè)24孔板中只留1株效價(jià)最高的菌株傳新斜面板，將生長(zhǎng)好的斜面板菌株再次用24深孔板進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩。獲得的高產(chǎn)菌種再進(jìn)行下一輪誘變篩選，經(jīng)過3輪誘變及篩選，共獲得20株效價(jià)提高100%以上的突變株，其中提高50%以上的12株，100%以上的5株，200%以上的3株。

對(duì)出發(fā)菌株(Wild type, WT)及效價(jià)提高200%的3株突變株(R5-9、R19-5、R36-27)在搖瓶上進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證(每株菌設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn))結(jié)果如表4。

圖1 海洋小單孢菌FIM02523的ARTP誘變致死率曲線Fig.1 The lethal rate of Micromonospora FIM02523 treated by ARTP

表4 24深孔板和搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩高產(chǎn)突變株的發(fā)酵效價(jià)對(duì)比Tab.4 Rakicin B1 production by Marine micromonospora grown in 24 deep-well plates or in shaking flasks

表5 突變株遺傳穩(wěn)定性考察Tab.5 Genetic stability analysis for high productive mutants to produce rakicidin B1

由表4可以看出不同菌株在搖瓶和24深孔板發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)rakicidin B1的發(fā)酵單位變化趨勢(shì)基本一致，也驗(yàn)證了24深孔板可用于海洋小單孢菌發(fā)酵產(chǎn)生rakicidin B1的發(fā)酵培養(yǎng)及菌株篩選。

2.5 遺傳穩(wěn)定性

選擇產(chǎn)量最高的3株菌進(jìn)行傳代和遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。由表5可以看出高產(chǎn)突變株R5-9、R19-5、R36-27遺傳穩(wěn)定性均較好，其中菌株R36-27最高比出發(fā)菌株效價(jià)提高約237.9%，效價(jià)達(dá)到490mg/L左右，可以將其作為后續(xù)誘變和發(fā)酵工藝優(yōu)化的菌株，其余兩株菌作為備選菌株暫時(shí)保藏。

3 討論

優(yōu)良的菌種是實(shí)現(xiàn)海洋來源微生物藥物產(chǎn)業(yè)化的根本，而在海洋來源的微生物菌株選育中，高突變率的誘變手段及高通量的篩選方法更是至關(guān)重要。本文首次將ARTP誘變技術(shù)、慶大霉素抗性選育及高通量篩選技術(shù)綜合應(yīng)用于海洋來源的小單孢菌產(chǎn)rakicidin B1的高產(chǎn)菌株選育。建立基于深孔板發(fā)酵rakicidin B1高產(chǎn)菌種的高通量篩選方法，與傳統(tǒng)搖瓶篩選方法相比，該方法操作簡(jiǎn)便，縮短了菌株篩選周期，加大了菌株初篩數(shù)量，可高效、低成本、快速篩選海洋來源小單孢菌rakicidin B1的高產(chǎn)菌株。

篩選獲得的高產(chǎn)菌株R36-27效價(jià)由出發(fā)菌株的144mg/L提高到490mg/L左右，提高了237.9%，且遺傳穩(wěn)定性良好。表明了核糖體工程技術(shù)(慶大霉素抗性)、ARTP誘變技術(shù)及高通量篩選技術(shù)綜合應(yīng)用于rakicidin B1高產(chǎn)菌的篩選，是有效的、可行的。