辣木多酚抑制結腸癌細胞增殖及促進細胞凋亡的作用①

楊 敏 李文云 馬 莉 解 靜 李凌飛 田 洋1,③

(1 云南農業大學食品科學技術學院 云南昆明650201;2 國家辣木加工技術研發中心 云南昆明650201)

結腸癌是發生在結腸部位的消化道常見惡性腫瘤，也是世界四大腫瘤之一［1]。根據世界流行病學調查報告，結腸癌發病率最高的地方是北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等地［2]。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，中國結腸癌的發病率逐年上升，流行病學研究表明，除了遺傳因素外，結腸癌的病因與飲食密切相關。研究表明，食用紅肉與結直腸癌的發生呈正相關，食用魚、蔬菜和水果與結直腸癌的發生呈負相關［3]。目前結腸癌的主要治療方法是手術和化療，手術創傷較大且有復發的風險，化療藥物副作用較大，可抑制人體免疫功能，對人體功能造成損害。近年來，開發天然的腫瘤預防、干擾物質尤其受到重視，其中最有希望的是一類來源于植物活性成分中的多酚類物質［4]，植物多酚不僅具有抗炎殺菌的作用，還與癌癥低發有密切聯系。多酚抗癌作用機理主要與其抗氧化、抗突變、調節免疫、抑制致癌物導致的癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡、抑制致癌基因表達、調控信號傳導及影響機體酶活性等有關［5-8]。

辣木（Moringa oleiferaLam）為辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木，耐旱能力強，廣泛種植于亞洲、非洲的熱帶及亞熱帶地區［9]。辣木又稱為“奇跡之樹”，是一種含有豐富營養成分且極具藥用價值的植物，可作為增強體力、降糖降脂、抑制病菌、抗癌防癌等天然的植物來源食品［10]。辣木葉是辣木中富含多酚、黃酮、蛋白質及微量元素的部位。中國衛生部門于2012年11月12日在《中華人民共和國衛生部2012年第十九號公告》中將辣木葉批準為新資源食品［11]。辣木葉含有大量抗氧化活性物質，Siddhuraju 等［12]發現，辣木葉的醇提物抗氧化活性達66.8%，具有良好的自由基清除能力。另外，辣木葉中的抗氧化組分也可以抑制自由基引起的氧化低密度脂蛋白的產生，達到降血脂和防止動脈粥樣硬化的作用。同時辣木葉還能抑制人體腫瘤細胞增殖，例如Tiloke 等［13]發現，辣木葉提取物可以抑制肺癌細胞A549 的生長。Berkovich 等［14]發現，辣木葉提取物通過干預NF-κB信號通路抑制了胰腺癌細胞的生長，這主要是由于辣木葉提取物中富含多酚類化合物。

辣木葉多酚是辣木葉中所含多元酚類的總稱。研究發現，辣木葉多酚的體外抗氧化活性是同等質量濃度VC 的75%以上［15]，除具有較強的抗氧化活性外，辣木葉多酚還有抑菌、消炎、抗癌、抗菌、抗病毒、保護肝臟、降血壓等多種醫療價值和生物功效［16-18]。Singh 等［19]通過高效液相色譜分析發現，辣木葉中含有沒食子酸、綠原酸、鞣花酸、阿魏酸、山奈酚、槲皮素、香蘭素等酚類單體成分。Kashiwada 等［20]從5 kg 辣木葉中分離出了10 種活性化合物成分，其中含有異槲皮苷（3.5 g）、槲皮素2 種衍生物（1.16 g）、山奈酚（364 mg）、綠原酸（120 mg）等，這些酚類單體均具有抑制腫瘤、抗炎消毒等作用。

雖然辣木提取物具有多種功效，但以往的研究主要涉及辣木及其提取物的抗氧化活性或功能食品開發。關于辣木葉醇提物中多酚類物質及其含有的主要酚類單體對人結腸癌細胞的抑制作用尚未見報道。因此本研究通過MTT 細胞活率測定、細胞克隆形成及劃痕實驗、細胞凋亡實驗及檢測凋亡蛋白的表達，探究辣木多酚提取物及其主要酚類單體化合物在結腸癌HCT116 細胞中的抗癌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

辣木葉粉購于云南天佑科技開發有限公司；人結腸癌細胞系HCT116、人結腸正常上皮細胞系NCM460 均購于中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫。3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基四唑溴化物噻唑藍（MTT）、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自北京索萊寶科技有限公司；F-12 高糖培養基、DMEM 高糖培養基均購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Thermo Scientific 公司；槲皮素、異槲皮素、蘆丁、山奈酚、綠原酸、金絲桃苷均購自美國Sigma-Aldrich 公司，純度≥99%；Annexin V/PIFITC細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；抗體Bax、Bcl-2均購自美國Cell Signaling Technology公司；抗體Tublin購于英國Abcam公司。

1.1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（安徽安泰空氣技術有限公司）；二氧化碳培養箱（蘇州貝茵醫療器械有限公司）；Countess 細胞計數器（美國Thermo Scientific 公司）；XDS-800C 型倒置電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；全波長酶標儀（BioTek Instruments 公司）；SC3616 型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；XMTD203 型恒溫水浴鍋（中國江蘇太倉華利達實驗設備有限公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；電泳槽電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 辣木葉多酚提取

參考趙謀明等［21]、沈慧等［22]的方法，采用超聲輔助乙醇提取法從辣木葉中提取多酚。先將辣木葉粉碎，過40 目篩；稱取3 份辣木葉干粉，每份30 g，按照1∶10 的料液比體系分別加入體積分數為20%、50%、80 %的乙醇溶液，在溫度60℃，超聲功率800 W 的條件下提取60 min，6000 r/min離心8 min，棄去沉淀收集上清液；將殘渣按照上述方法反復提取2次，合并所有上清液后在40℃條件下旋轉蒸發濃縮20 min；采取冷凍干燥的方法獲得辣木葉多酚粉末，樣品放置于-80 ℃保存。

1.2.2 辣木葉多酚濃度的測定

參考趙謀明［21]、林詩洋［23]等方法，采用福林—酚法測定辣木葉中多酚含量，以沒食子酸為標準品，設定標準溶液質量濃度為0、10、30、50、70、100、150、200、300、400、500 mg/mL；吸取1 mL 辣木葉多酚粗提液，加入0.5 mL 福林酚試劑，充分搖勻后加入質量分數為20%的飽和碳酸鈉溶液1.5 mL；之后補加7 mL 去離子水定容至10 mL，室溫下避光孵育1 h，以4℃12000 g 離心8 min，于760 nm 波長處測量吸光度。獲得的標準曲線方程為：y＝2.1438x＋0.1308（R2＝0.9938）。

1.2.3 細胞培養

將HCT116 細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的F-12 培養液中，將NCM460細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈酶素混合液的DMEM 培養液中，置于37℃，含5% CO2培養箱中培養。

1.2.4 細胞活力測定

取對數生長期的HCT116 細胞和NCM460 細胞，接種于96 孔板中培養，24 h 后棄去培養液，分別加入不同濃度的辣木多酚（50、100、200、400 μg/mL）處理細胞。此外選用辣木多酚中6 種主要單體成分蘆丁、山奈酚、綠原酸、槲皮素、異槲皮素、金絲桃苷分別處理細胞，每種藥物濃度均為（5、10、20、40、80 μg/mL），同時以不添加辣木多酚組別為空白對照組；置于37℃、5%CO2細胞培養箱中，分別孵育24、48、72 h 后；各孔加入10 μL MTT溶液，繼續孵育4 h，在酶聯免疫檢測儀上490 nm 波長處測定各孔吸光度（A 值），按照以下公式計算細胞增殖抑制率。

1.2.5 細胞克隆形成能力測定

將HCT116 細胞接種于6 孔板中，用80%乙醇提取的辣木多酚處理細胞48 h 后，換含有胎牛血清的培養基繼續培養細胞；至空白對照組細胞生長至80%，用預冷的PBS 洗2 次，4%多聚甲醇固定液固定10 min；棄去甲醇固定液，加入0.1%結晶紫染色30 min，用PBS 清洗后風干并拍照，計數克隆并按照下式計算細胞克隆形成率。

1.2.6 細胞劃痕生長能力測定

將HCT116 細胞接種于6 孔板，待孔中細胞密度長至80%時，用200 μL 塑料移液管頭垂直于孔板，自上而下制造劃痕，棄去培養基，加入辣木多酚處理，拍照后繼續培養48 h；后用PBS 溶液沖洗2 次，加入不含胎牛血清的培養液，拍照記錄，使用Image J Pro軟件計算各組劃痕部位細胞遷移面積。

1.2.7 細胞凋亡檢測

將HCT116 細胞接種于培養皿中，加入80%乙醇提取的辣木多酚繼續培養；用不含EDTA 的胰酶消化離心收集細胞，冰PBS 清洗3 遍，收集細胞，以1200 r/min 離心3 min；棄去上清液，按照AnnexinV-FITC 凋亡試劑盒說明書進行染色，加100 μL 1×Binding Buffer 重懸細胞后，加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，輕輕混勻，避光，室溫反應15 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，以200 目濾布過濾后將樣品置于冰上，采用流式細胞儀和Flow Jo 9.0軟件檢測并分析細胞凋亡情況。

1.2.8 細胞蛋白表達量檢測

為進一步探究辣木多酚對結腸癌細胞凋亡的分子機制，采用Western blot 技術對HCT116 細胞內2 個主要凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2 進行檢測。將細胞按每皿9×105個接種于培養皿中培養，加入辣木多酚，培養48 h 后用PBS 清洗3 遍，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，于4℃下12000 r/min 離心10 min后取上清液；采用BCA法測定細胞蛋白濃度，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電泳結束后在冰水浴條件下將分離膠上蛋白轉移至PVDF膜上；采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后孵育抗體4℃過夜，經TBST 清洗3 遍后孵育兔抗1 h，加入ECL 試劑發光成像，拍照，并用Image J 軟件進行灰度值分析。

1.2.9 數據統計與分析

測量數據用（均數±標準差）表示，采用Graphpad Prism 5.0 軟件、SPSS 軟件進行實驗數據分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度乙醇提取的辣木多酚對結腸癌細胞增殖的影響

如圖1-A 所示，不同濃度（20%、50%、80%）乙醇提取的辣木多酚對人結腸癌細胞HCT116 增殖均有抑制作用，其中80%乙醇提取的辣木多酚對HCT116 細胞抑制效果最好，且隨著作用時間延長，處理濃度增加，抑制作用越明顯。當劑量為400 μg/mL 時，處理細胞48 h 后抑制率達到96.4%以上，抑制作用呈劑量依賴性。各濃度組細胞抑制率與對照組比較具有統計學差異。同時圖1-B顯示，不同濃度（20%、50%、80%）乙醇提取的辣木葉多酚對人結腸正常細胞NCM460幾乎無抑制作用，不影響其正常生長。

2.2 辣木多酚單體成分對結腸癌細胞增殖的影響

為明確辣木多酚提取物中單體成分對HCT116細胞增殖的抑制作用，選擇辣木葉中含量較高的6種酚類單體山奈酚、槲皮素、異槲皮素、綠原酸、蘆丁和金絲桃苷為原料，分別將這6 種單體以5、10、20、40、80 μg/mL 的濃度處理HCT116 細胞，孵育24、48、72 h后進行MTT實驗，測定細胞存活率，結果見圖2。所有單體處理細胞24～48 h 后，低濃度劑量下多種單體對結腸癌HCT116 細胞無顯著抑制作用，而高濃度40和80 μg/mL 劑量下對HCT116 細胞有一定抑制作用，但抑制率不高。80 μg/mL 的山奈酚、槲皮素、異槲皮素、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷分別處理HCT116 細胞72 h，其抑制率 分 別 為28.34%、 48.12%、 45.03%、 43.27%、42.56%和44.85%。與辣木多酚混合物相比，酚類單體對結腸癌細胞的抑制效果均沒有辣木多酚混合物好，推測辣木多酚對HCT116 細胞的抑制作用可能是通過多種單體協同作用。

2.3 辣木多酚對結腸癌細胞HCT116 生長遷移能力的影響

經結晶紫染色固定后，辣木多酚處理HCT116細胞的克隆形成率如圖3-A、3-B 所示。與對照組相比，50、100、200 μg/mL 辣木多酚處理組的克隆形成率顯著降低，且隨著藥物濃度的增加，細胞克隆形成數呈降低趨勢。為進一步觀察辣木多酚處理后細胞的遷移能力，采用劃痕實驗觀察并測量了細胞的遷移距離。結果表明，與對照組相比，辣木多酚處理組細胞的劃痕寬度明顯大于對照組，24 h后對照組細胞已出現愈合跡象，而辣木多酚處理組劃痕沒有愈合（圖3-C、3-D）。表明80%乙醇提取的辣木多酚阻礙結腸癌HCT116細胞的遷移能力具劑量依懶性。

2.4 辣木多酚對HCT116細胞凋亡的影響

凋亡細胞的顯著特征是細胞膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，并能夠特異性結合Annexin V染料，PI 是一種核酸染料，可以透過凋亡細胞和晚期細胞的細胞膜進行特異性結合。本研究采用Annexin V/PI 雙染法檢測80%乙醇提取的辣木多酚處理人結腸癌HCT116細胞48 h后的凋亡誘導效應。結果如圖4-A 所示。Annexin V 陽性凋亡細胞隨多酚混合物濃度的增加而增加。如圖4-B所示，與對照組相比，50、100、200 μg/mL 多酚處理后細胞凋亡率（早期凋亡細胞＋晚期凋亡細胞）分別為19.2%、23.57%、30.62%，表明80%乙醇提取的辣木多酚可以促進結腸癌細胞凋亡。此外，通過Western blot技術從分子機制方面探究了凋亡調節蛋白Bcl-2、Bax的表達情況（圖4-C、4-D、4-E），分別用50、100、200 μg/mL的80%乙醇提取的辣木多酚處理細胞48 h 后，HCT116 細胞中促凋亡蛋白Bax的表達有增加趨勢，而細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達水平降低，表明辣木多酚誘導的細胞凋亡可能是由內在凋亡途徑所驅動的。

3 討論

本研究以辣木葉為原料，評估了辣木多酚及其中主要酚類單體在結腸癌細胞中的抗腫瘤作用，采用3 種不同濃度（20%、50%、80%）乙醇溶液提取的辣木多酚作用于人結腸癌HCT116細胞后發現，80%醇提辣木多酚的抑制作用優于20%和50%醇提多酚。當劑量達到400 μg/mL時，HCT116細胞的抑制率達96.4%以上。Lin 等［24]、Yi 等［25]研究藍莓多酚和蘋果多酚的抗結腸癌作用時發現，當蘋果多酚和藍莓多酚的濃度分別達到2和10 mg/mL 時，才能抑制結腸癌細胞的生長［24-25]。因此，與其他植物多酚相比，辣木葉多酚似乎發揮了更多抗結腸癌的作用。為了明確辣木葉多酚中單體成分對結腸癌增殖的抑制效果，本研究選用山奈酚、槲皮素、綠原酸、異槲皮素、蘆丁、金絲桃素6種辣木多酚單體作用于HCT116 細胞，結果表明，多酚單體對HCT116 細胞增殖的抑制作用遠不如多酚提取物，表明多酚類單體主要通過協同作用來發揮抗結腸癌作用。也有研究表明，大多數植物提取物不是單一成分作用，而是多種物質的協同作用和凝集作用［26-27]。

細胞凋亡是維持細胞增殖和死亡動態平衡中非常重要的因素，細胞凋亡功能的喪失或受抑制是腫瘤發生的一個非常重要的因素［28]。在腫瘤治療中腫瘤細胞是否凋亡是判斷腫瘤治療成功與否的關鍵因素之一。因此，抑制癌細胞的增殖和遷移并提高細胞凋亡的速率是藥物具有抗癌作用的前提［29-30]。本研究發現，辣木多酚不僅能明顯抑制HCT116 細胞的克隆形成和細胞遷移，而且能夠使HCT116 細胞凋亡率增加；蛋白免疫技術的結果也表明，辣木多酚處理HCT116 細胞后，主要調控凋亡的2 種蛋白（Bax和Bcl-2）的表達發生了變化，其中，促進凋亡的Bax 蛋白表達有增加趨勢，而抗凋亡的Bcl-2 蛋白表達顯著降低，這2 種蛋白表達的改變導致HCT116 細胞凋亡加速，表明辣木多酚抑制結腸癌HCT116 細胞增殖的潛在機制可能與促進細胞凋亡有關。