有氧運動聯合丹皮酚PLGA 納米粒對肥胖伴高脂血癥大鼠的保護作用

劉 靜,肖明中

(1.武漢民政職業學院康復醫療學院,武漢 430079; 2.湖北省中醫院肥胖體重管理中心,武漢 430074)

高脂血癥在流行病學上與心血管疾病的發展有關,是動脈粥樣硬化發病的重要危險因素和決定因素,伴隨著總膽固醇(TC)的積累,還包括膽固醇和血清甘油三酯水平的增加[1]。 脂質、血管系統細胞和炎癥部位的免疫細胞相互作用促進動脈粥樣硬化的發生[2-3]。 內皮和血管炎癥是高脂血癥和動脈粥樣硬化的主要原因,是心血管疾病的發展誘因[4]。

丹皮酚是中藥白芍根皮的主要活性成分,丹皮酚具有多種生物活性：鎮痛、抗菌、抗炎等作用,已被廣泛用于治療肌肉疼痛、關節疼痛、風濕、神經痛和心血管等疾病[5]。 丹皮酚能改善血液循環和促進活性氧的產生[6],是治療變應性鼻炎、色素沉積、皮膚瘙癢和濕疹的有效選擇。 但是由于其水溶性差,易揮發和氧化臨床應用受到限制。 近年來納米給藥系統作為難溶性藥物的遞送載體受到廣泛關注,因此本研究將其制備成丹皮酚PLGA 納米粒,以增強其穩定性。 除藥物干預外,通過有氧運動也能夠調節機體的機能,降低血脂水平[7]。 目前的研究中有氧運動結合中藥活性成分進行高脂血癥的防治作用研究較少,暫無有氧運動聯合丹皮酚PLGA納米粒防治高脂血癥的報道與研究。 本研究旨在通過構建肥胖伴高脂血癥大鼠模型并進行有氧運動和丹皮酚PLGA 納米粒干預,研究其對高脂血癥大鼠的影響,初步探討有氧運動和丹皮酚PLGA 納米粒對高脂血癥的影響機制及其防治效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD 雄性大鼠40 只,體質重(160 ± 10)g,來源于北京華阜康生物科技有限公司[SCXK(京)2014-0004],動物在標準化條件下飼養[SYXK(鄂)2018-0122],實驗操作經動物倫理委員會審批,審批號為20180112。 自由飲食和飲水,控制環境溫度為22℃～28℃,相對濕度為40% ～60%,飼養環境每日光照時間為12 h, 整個動物實驗過程中嚴格按實驗動物使用的3R 原則給予實驗動物人道關懷。

1.2 主要儀器與試劑

丹皮酚(純度＞98.0%),購自于大連美侖生物科技有限公司,批號20181221;PLGA(50/50,粘度0.47)購自于濟南岱罡生物工程有限公司,批號20180717;血液生化指標檢測試劑盒均購自于南京建成生物科技有限公司,其中總肝固醇(TC)為批號20180422; 高密度脂蛋白( HDL-C) 批號為20180618;甘油三酯(TG)批號為20180902;脂蛋白酯酶(LPL)批號為20180526;肝脂酶(HP)試劑盒批號為20180115,大小鼠平板跑步機,上海玉研科學儀器有限公司;全自動血生化分析儀,德國豪邁克公司;光學顯微鏡,日本奧林巴斯;高速冷凍離心機,上海安亭科學儀器廠;場發射透射電子顯微鏡,日本JEOL。

1.3 實驗方法

1.3.1 丹皮酚PLGA 納米粒的制備

參考文獻采用納米沉淀法制備丹皮酚PLGA 納米粒[8]。 稱取處方量丹皮酚和PLGA 溶于乙腈中作為有機相,用500 r/min 磁力攪拌均勻,將有機相滴加到去離子水中,繼續攪拌1 h 使其固化,固化完成后溶液旋轉蒸發除去乙腈,即得丹皮酚PLGA 納米粒,并通過透射電鏡對其進行表征。

透射電鏡樣品的制備：制備丹皮酚PLGA 納米粒,通過透射電子顯微鏡對納米顆粒的表面形態進行觀察。 取上述制備的丹皮酚PLGA 納米粒,使用去離子水稀釋100 倍,取5 μL 加入到銅網上,用干凈的濾紙片吸走多于液體,自然晾干后于透射電子顯微鏡下觀察。

1.3.2 模型構建及分組

大鼠適應性飼養一周后將其分為正常對照組(8 只)和肥胖伴高脂血癥模型組(32 只)。 正常對照組飼喂普通飼料,肥胖伴高脂血癥模型組給予高脂飼料(普通飼料是由玉米、麥麩、大豆粉、復合微生素,多種添加劑混合制備而成,高脂飼料再此基礎上添加10%豬油混合制備而成),兩組均自由飲水。 每周對大鼠測量體質重,當大鼠體重超過正常對照組體重20%以上時,即判定模型成功[9]。 飼養8 周后眼球取血,通過全自動血生化分析儀進行分析,構建肥胖伴高脂血癥大鼠模型,(空白對照組和模型組體重及TG 和TC 含量有統計學差異(P ＜0.05)。 隨后選取造模成功的模型大鼠隨機分為4組：模型對照組(Model),有氧運動組(MS),丹皮酚PLGA 納米粒組(MP),有氧運動聯合丹皮酚PLGA納米粒組(SP)。

1.3.3 處理及給藥

分組后MS 組大鼠每天上午9：00-10：00 進行60 min 的中等強度有氧運動,第一周進行10 m/min適應性訓練,隨后的實驗中以12 m/min 的恒定速度運動60 min[10]。 MP 組大鼠每天上午9：00 口服灌胃丹皮酚PLGA 納米粒溶液,給藥劑量為250 mg/kg[11]; SP 組大鼠每天上午9：00 灌胃后進行有氧運動訓練,Model 組則上午9：00 給予相同體積的生理鹽水。 實驗期間動物自由飲水和飲食,定期更換墊料和籠具,每周記錄體重變化。

1.3.4 取材及處理

各組模型大鼠經經不同手段干預6 周后,動物禁食不禁水過夜,將動物麻醉后經腹主動脈取血,全血經3500 r/min 離心10 min,分離得到血清,吸取上層血清轉移至離心管內,于-20℃冰箱保存備用,大鼠血清血生化檢測指標TG、TC、HDL-C、LPL 和HL 含量的測定嚴格按照檢測試劑盒說明書進行操作。

動物取血后實行安樂死,解剖并取出肝臟組織和腹股溝皮下脂肪組織,取完整的肝臟組織用生理鹽水沖洗表面并用濾紙吸干水分后稱重,計算肝臟系數。 同時取大鼠腹股溝皮下脂肪組織,生理鹽水沖洗表面后用4%甲醛溶液固定,進行HE 染色病理學觀察,Image J 軟件測量脂肪細胞面積(×200),每份標本測量5 個視野[12]。

1.4 統計學分析

使用SPSS 19.0 統計分析軟件對實驗結果進行統計分析,數據以平均數±標準差(±s)表示,多組比較采用one-way ANOVA 分析和兩兩比較的LSD 檢驗,非正態分布采用秩和檢驗進行比較。 以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹皮酚PLGA 納米粒透射電鏡表征結果

由圖1 可知,制備的丹皮酚PLGA 納米粒形態圓整,成球形或類球形,粒徑在200 nm 左右,分布較為均勻。

2.2 不同處理方法對模型大鼠體重的影響

實驗期間各組肥胖伴高脂血癥模型大鼠的體重變化情況如圖2 所示,由結果可知,未經任何處理的模型大鼠體重增長最為迅速,與初始體重相比,其體重增長率高達(48.1±4.23)%;當給予不同的干預后,各組大鼠體重呈現不同程度的增長減緩,其中SP 組體重增長最慢, 增長率為(16.7 ±2.17)%,與模型對照組相比,有統計學差異(P ＜0.01)。

2.3 不同處理方法對模型大鼠血清血生化參數及肝系數的影響

圖1 丹皮酚PLGA 納米粒透射電鏡及粒徑分布Figure 1 Transmission electron microscopy depicted the particle size distribution of paeonol PLGA nanoparticles

各組模型大鼠血清中TC、TG、HDL-C 和肝系數的變化如表1 所示,經過6 周的不同手段干預后,相比于正常對照組(Normal)組,Model 組的TG、TC 和肝系數水平顯著升高(P ＜0.01 和P ＜0.05), HDL-C 水平降低(P ＜0.05),表明高脂飲食的誘導可成功誘發大鼠體內的脂質代謝紊亂,誘發高脂血癥。

圖2 各組大鼠體重變化趨勢Figure 2 Trends of the body weight of rats in each group

造模成功后對模型大鼠給予不同條件的干預,對其血生化結果進行分析,其血清血生化參數和肝系數呈現不同的變化,其中與Model 組相比,SP 組的TC 和TG 水平顯著降低(P ＜0.01),HDL-C 水平升高(P ＜0.05),肝系數也較Model 組降低(P ＜0.05),各項指標已經比較接近Normal 組的水平,單純的有氧運動或者丹皮酚PLGA 納米粒組干預也會有一定的改善模型大鼠高脂血癥的效果,但其效果不如聯合干預組,且兩組相比沒有統計學差異。

2.4 對脂代謝關鍵酶的調節

與Normal 組相比,Model 組模型大鼠的血清中LPL 和HL 的含量顯著降低,差異存在統計學差異(P ＜0.01);與Model 組相比較,當給予不同方法干預后,大鼠的血清中LPL 和HL 的含量呈現不同程度的升高,其中SP 組的含量升高最為顯著,具有統計學差異(P ＜0.01),結果見表2。

2.5 腹部脂肪細胞變化

有氧運動和丹皮酚PLGA 納米粒干預后對肥胖伴高脂血癥大鼠腹部脂肪細胞數目和大小的影響結果見表3,實驗結束后,經Image J 對腹部脂肪細胞面積進行測量后, 結果顯示：Model 組大鼠脂肪細胞飽滿,結構清晰,Model 與其他處理組相比,在相同視野下可觀測到更多的脂肪細胞數目,并且脂肪細胞的大小要比其他處理組要大,如圖3,通過不同的方法干預后,腹部脂肪細胞不同程度的減小,且SP 組大鼠的腹部脂肪細胞更小,相同視野面積下能觀測到更多的細胞(P ＜0.01)。

表1 不同處理方法對模型大鼠血清血生化參數及肝系數的影響(±s, n=10)Table 1 Effects of different treatments on serum biochemical parameters and liver coefficient of the rats

表1 不同處理方法對模型大鼠血清血生化參數及肝系數的影響(±s, n=10)Table 1 Effects of different treatments on serum biochemical parameters and liver coefficient of the rats

注：與Normal 組相比,?P＜0.05,??P＜0.01;與Model 組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the normal group,?P＜0.05,??P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05,## P＜0.01.

組別Group總膽固醇(mmol/L)TC甘油三酯(mmol/L)TG高密度脂蛋白(mmol/L)HDL-C肝系數Liver coefficient Normal 2.21±0.09 0.95±0.07 0.86±0.16 2.36±0.12 Model 3.24±0.22?? 2.25±0.19?? 0.65±0.16? 3.26±0.15?MS 2.81±0.13## 1.82±0.26## 0.72±0.11 2.89±0.14#MP 3.02±0.16## 1.96±0.14 0.84±0.08 3.18±0.13#SP 2.57±0.12## 1.18±0.11## 0.87±0.07# 2.47±0.19#

表2 不同干預手段對各組大鼠脂代謝關鍵酶水平的影響(±s, n=10)Table 2 Effects of different interventions on the levels of key lipid metabolic enzymes in the rats

表2 不同干預手段對各組大鼠脂代謝關鍵酶水平的影響(±s, n=10)Table 2 Effects of different interventions on the levels of key lipid metabolic enzymes in the rats

注：與Normal 組相比,??P ＜0.01;與Model 組相比,# P ＜0.05,## P ＜0.01。Note. Compared with the normal group, ??P ＜0.01. Compared with the model group, # P ＜0.05, ## P ＜0.01.

組別Groups脂蛋白酶(pg/ mL)LPL肝脂酶(pg/ mL)HL Normal 54365±4468 26586±1389 Model 36748±2352?? 16820±1043??MS 46375±4462## 21134±993#MP 42937±35349# 19458±1232#SP 52459±48153## 25466±1934##

表3 不同干預后對各組大鼠腹部脂肪細胞數目和大小的影響(±s, n=10)Table 3 Effects of different interventions on the number and size of abdominal fat cells in the rats

表3 不同干預后對各組大鼠腹部脂肪細胞數目和大小的影響(±s, n=10)Table 3 Effects of different interventions on the number and size of abdominal fat cells in the rats

注：與Model 組相比,?P ＜0.05,??P ＜0.01。Note. Compared with the model group, ?P ＜0.05,??P ＜0.01.

組別Groups細胞數目Number of cells細胞大小(μm)Cell size細胞面積(μm2)Cell area Model 114±10.9 126.2±7.87 11125.6±1847.2 MS 167±9.3?? 91.27±7.91?? 8325.1±1226.3??MP 136±12.1?? 107.42±11.64? 9514.2±1449.9?SP 218±18.5?? 76.91±6.84?? 6455.2±1047.4??

圖3 各組大鼠腹部脂肪HE 染色Figure 3 Histology of abdominal fat tissues in the rats of each group.HE staining

3 討論

本研究通過有氧運動聯合丹皮酚PLGA 納米粒評價了在肥胖伴高脂血癥模型大鼠中的降脂作用。首先參考體重和血生化參數成功構建肥胖高血脂癥大鼠模型,隨后在經過一定時間的有氧運動和丹皮酚PLGA 納米粒干預后,各組模型大鼠不同程度的降低TG、TC 和HDL-C 水平,與對照組相比,SP組的大鼠體重下降最為顯著;通過有氧運動聯合丹皮酚PLGA 納米粒對其干預,提高了脂代謝酶LPL和HL 的含量。 高脂血癥的主要臨床表現是機體內的脂質代謝異常[13],內皮功能障礙和相關炎癥性疾病[14]。 可誘導動脈粥樣硬化的發生,而肝臟是脂質代謝的主要場所,因此通過調節脂質在肝臟中的代謝,可以調節體內血脂水平,抑制動脈粥樣硬化的形成。

PLGA 納米粒作為藥物遞送系統的載體,可顯著增加難溶性藥物的生物利用度[15],可以降低機體內皮網狀系統的清除,增加藥物在體內的循環時間,改變藥物在機體內的分布和代謝行為[16]。 丹皮酚屬于水不溶性藥物,臨床應用時其生物利用度不高,本研究將其通過PLGA 納米粒對其進行包載,使溶解度增加,為擴大臨床用藥提供了新思路。

有氧運動對于防治肥胖和高脂血癥早在文獻中得到證實[17-18]。 脂肪的代謝過程需要特定的脂肪代謝酶和脂蛋白參與,有氧運動可以增加脂肪代謝酶在血清中的含量,從而進一步促進LDL-C 與HDL-C 的轉換, 在脂肪代謝酶的干預下,血清中LDL-C 水平降低,HDL-C 含量增加,并且可以促進TC 的分解,可以有效降低血脂水平。 本研究實驗結果表明,對于各組脂代謝關鍵酶水平的影響,MS 組和SP 組的大鼠LPL 和HL 水平均高于MP 組,此結果與文獻報道相一致,表明有氧運動對于防治肥胖和高脂血癥有一定的改善作用。

LPL(脂蛋白酯酶)是參與脂蛋白代謝的關鍵酶之一,在正常的脂質代謝和能量平衡中起著至關重要的作用[19],若是LPL 缺陷則能夠導致血漿內TG水平的異常,極易引發高脂血癥和動脈粥樣硬化等疾病。 LPL 是在脂肪細胞、心肌細胞、巨噬細胞和骨骼細胞中合成并分泌,在毛細血管內皮的管腔側發揮作用[20]。 其主要的生理作用是在載脂蛋白的激活下,對血液中的乳糜微粒和低密度脂蛋白進行水解生成甘油和游離脂肪酸,并且調節各種蛋白的代謝,促使含脂質微粒的蛋白進行降解[21]。 因此LPL水平的變化影響著體內脂代謝。 HL(肝脂酶)是與LPL 屬于同等性質的脂酶,與LPL 生理活性相似,均具有水解脂肪的作用[22]。 因此血清中HL 水平的異?？蓪е轮|代謝的紊亂,最終可能導致血清中其他脂蛋白的含量變化異常[23]。 本實驗通過研究表明,與未經任何處理的大鼠相比,有氧運動組、丹皮酚PLGA 納米粒組、有氧運動聯合丹皮酚PLGA 納米粒組的LPL、HL 水平均不同程度的升高,其中有氧運動聯合丹皮酚PLGA 納米粒組的LPL、HL 血清含量最高,血清中LPL、HL 水平的升高有效的降低了血液中TG、TC 的水平,上調了血清中HDL-C 含量;通過對其腹股溝皮下脂肪形態觀察發現SP 組細胞較其他組面積減小,推測可能是血液中的高LPL 水平促進了脂肪的分解,脂肪細胞面積減小,體重減輕。 因此有氧運動和丹皮酚PLGA納米粒對高血脂癥大鼠的保護作用可能與其升高LPL、HL 血清水平,促進脂肪分解有關。

綜上所述,本研究在建立肥胖伴高脂血癥的大鼠模型基礎上,通過有氧運動和丹皮酚PLGA 納米粒的干預,改善了大鼠血清中LPL、HL 水平,從而進一步可以降低血液中TG、TC 的含量,同時上調了血清中HDL-C 含量。 然而對于其作用機制尚不清楚,將在后續的研究中做深入的探討。