痔瘡磁化膏對小鼠痔瘡模型的保護作用

王善超,劉江濤,張則彥,張海洋,高千福

(臨沂市人民醫院,山東 臨沂 276000)

痔瘡又名痔核、痔病,是一種常見的多發的肛腸類疾病[1],它是由肛管血管墊的支持結構、靜脈叢、動靜脈吻合支發生病變或下移及齒線遠側靜脈叢病理性擴張或血栓形成導致的[2],在發病過程中,大量炎性細胞如漿細胞、淋巴細胞、中性粒細胞浸潤及肉芽腫形成炎癥反應,導致局部潰瘍形成[3-4]。 痔瘡的主要癥狀有肛周出現水腫、疼痛以及瘙癢甚至脫墜,可伴有便血,遷延反復,給患者的生活帶來諸多痛苦。 目前,臨床上輕中度痔瘡主要采用藥物治療,一些嚴重的內痔和混合痔,多采用手術的治療方式[5-6]。 但是,無論是藥物治療還是手術治療,都很難根治痔瘡。 中醫理論指導下的物理治療是臨床新興的痔瘡非手術治療方式,具有簡、便、廉、捷等優點,療效顯著,受到國內外廣泛關注。

國家二類醫療器械痔瘡磁化膏推射器的主要藥效成分為痔瘡磁化膏,它是由遠紅外基材粉末、磁石粉、釹鐵硼磁鐵片、羊毛脂等混合成的乳膏,具有促進細胞代謝、改善血液循環、調節血壓、增強機體免疫力、提高紅細胞攜氧能力、消炎消腫止痛等功效。 臨床研究表明,痔瘡磁化膏治療內痔、外痔、混合痔的總體有效率為88.33%,在痔瘡的治療中具有獨特的優勢,主要用于保守治療痔瘡患者,如門診檢查病變程度為Ⅲ期以下者,痔瘡誘發疼痛、腫脹、出血等癥狀明顯患者,以及指檢、腸鏡等檢查后疼痛者;同時也可用于術后康復痔瘡患者,可由本調理,改善微循環,消腫消炎止痛,預防感染,護理腸道,軟化腸道壁,保持排便通暢,提高組織再生能力,加快患者術后康復,恢復肛周健康。 但是痔瘡磁化膏治療痔瘡的作用機制尚不清楚,本文通過建立醋酸誘導的小鼠痔瘡模型,考察痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠的治療效果,并從炎癥角度研究其治療痔瘡的機制,為痔瘡磁化膏的臨床應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性ICR 小鼠,6～7 周齡,體質量30～34 g,40 只,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK(魯)2014-007]。 實驗動物關懷及使用委員會(IACUC)批準編號：HN-IACUC-2018-056,實驗過程嚴格遵守實驗動物3R 原則和實驗室動物倫理要求。 實驗在中藥制藥共性技術國家重點實驗室SPF級屏障動物實驗設施進行[SYXK(魯)2018 008],動物房飼養環境：(22±2)℃,相對濕度60%,12 h/12 h 晝夜環境,自由攝食和飲水。 適應性飼養1 周,適應飼養環境后即開始實施造模實驗方案。

1.2 主要試劑與儀器

痔瘡磁化膏(哈爾濱運美達生物科技有限公司,批號20180907);馬應龍麝香痔瘡膏(馬應龍藥業集團股份有限公司,批號170209);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,批號AR1180);小鼠炎癥因子CBA 試劑盒(BD Pharmingen,批號552364);Griess 試劑盒(美國Promega 公司,批號0000131725)。

Tissue-Tek?VIPTM5 Jr 全封閉組織脫水機、Tissue-Tek?TECTM5 組織包埋機(日本櫻花檢驗儀器株式會社);TP1020 脫水機、RM2235 輪轉式病理切片機、HI1210 組織攤片機、ST5020 自動染色機(德國徠卡儀器有限公司);MultiSkan GO 酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及治療

40 只ICR 小鼠按體重隨機分為正常組(10只)、造模組(30 只),造模組小鼠肛門內0.5 cm 處推注0.05 mL 濃度為20%的乙酸溶液,保持1 min,正常組以等量的生理鹽水代替[7]。 造模24 h 后,具有白色潰瘍面、肛周腫脹并伴隨炎癥滲出表明造模成功[8]。 造模成功后,造模組按腫脹大小隨機分為模型組、痔瘡磁化膏組和馬應龍麝香痔瘡膏組,每組10 只動物。 痔瘡磁化膏組在肛周涂抹200 μL 痔瘡磁化膏,馬應龍麝香痔瘡膏組在肛周涂抹200 μL馬應龍麝香痔瘡膏,每天兩次,連續涂抹11 d,正常組和模型組以等量生理鹽水代替。

1.3.2 肛周評分

最后一次治療12 h 后,清除痔瘡磁化膏或馬應龍麝香痔瘡膏,清洗肛周,進行肛周評分。 評分標準見表1[8]。

表1 肛周評分主要表觀分級Table 1 Main apparent grading of perianal scores

1.3.3 直腸組織病理學檢測

肛周評分后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠,取直腸組織,HE 染色觀察直腸組織病理變化,并進行分級[9]。 -：直腸粘膜腺上皮排列整齊未見其它病理改變;+：直腸粘膜腺上皮排列整齊偶見炎性細胞浸潤;++：直腸粘膜腺上皮增生、排列紊亂,粘膜下見大量炎癥細胞浸潤;+++：直腸粘膜缺損、壞死,表面附著炎性滲出,大量炎細胞浸潤,結締組織增生。

1.3.4 血清炎性細胞因子檢測

最后一次給藥12 h 后麻醉動物,腹主靜脈取血,分離血清,根據CBA 試劑盒說明書檢測外周血IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量。

1.3.5 血清NO 含量檢測

根據說明書要求,利用Greiss 試劑盒檢測血清NO 的含量。

1.4 統計學分析

采用SPSS 18.0 軟件處理數據,實驗結果用平均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析和t 檢驗, 等級資料采用Ridit 檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠肛周評分的影響

與正常組相比,模型組所有小鼠大便干枯、便血、肛門潮濕、肛周腫脹、肛周潰瘍及肛門瘀斑評分均顯著升高(P＜0.05),提示本文所述造模方法模型成功率為100%;與模型組相比,痔瘡磁化膏組和馬應龍麝香痔瘡膏組小鼠大便干枯、便血、肛門潮濕、肛周腫脹、肛周潰瘍及肛門瘀斑評分均顯著降低(P＜0.05),且在大便干枯、便血、肛周潰瘍、肛門瘀斑等指標中,痔瘡磁化膏肛周評分顯著低于馬應龍麝香痔瘡膏組(P＜0.05)。 見表2。

2.2 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠直腸組織病理學的影響

正常組直腸黏膜腺上皮排列整齊,未見病理學改變;模型組局部組織粘膜缺損,表面有大量炎性細胞浸潤及組織壞死,并伴雖有肉芽組織形成(圖1),病理分級多處于++級和+++級;與模型組相比,痔瘡磁化膏組和馬應龍麝香痔瘡膏組直腸局部組織病理學明顯改善,且痔瘡磁化膏組效果要優于馬應龍麝香痔瘡膏組(表3)。

表2 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠肛周評分的影響( ±s,n = 10)Table 2 Effect of hemorrhoid magnetized cream on perianal scores in the hemorrhoid mice( ±s,n = 10)

表2 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠肛周評分的影響( ±s,n = 10)Table 2 Effect of hemorrhoid magnetized cream on perianal scores in the hemorrhoid mice( ±s,n = 10)

注：與正常組相比,??P＜0.01;與模型組相比,#P＜0.05,##P＜0.01;與痔瘡磁化膏組相比,&P＜0.05。Note. Compared with the normal group, ??P ＜0.01. Compared with the model group, #P ＜0.05, ##P ＜0.01. Compared with the hemorrhoid magnetized cream group, &P ＜0.05.

分組 大便干枯 便血 肛門潮濕 肛周腫脹 肛周潰瘍 肛門瘀斑Groups Dry stool Hematochezia Anal wet Perianal swelling Perianal ulcer Anal petechia正常組Normal group 0.67±0.21 0.00±0.00 0.58±0.12 0.41±0.10 0.00±0.00 0.00±0.0模型組Model group 2.65±0.52?? 3.05±0.46?? 3.37±0.60?? 3.45±0.41?? 3.55±0.68?? 3.08±0.56??痔瘡磁化膏組Hemorrhoid magnetized cream group 1.53±0.45## 1.16±0.29## 2.08±0.51# 1.61±0.38## 1.37±0.49## 1.36±0.46##馬應龍麝香痔瘡膏組Ma Yinglong musk hemorrhoids cream group 2.15±0.46#& 1.85±0.48##& 2.05±0.48# 1.79±0.59## 1.98±0.43#& 1.99±0.62#&

圖1 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠直腸組織病理形態的影響(HE 染色)Figure 1 Effect of hemorrhoid magnetized cream on the pathology of rectal tissue in hemorrhoid mice. HE staining

表3 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠直腸組織病變分級的影響( ±s,n = 10)Table 3 Effect of hemorrhoid magnetized cream on local tissue pathology in the hemorrhoid mice( ±s,n = 10)

表3 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠直腸組織病變分級的影響( ±s,n = 10)Table 3 Effect of hemorrhoid magnetized cream on local tissue pathology in the hemorrhoid mice( ±s,n = 10)

分組 -級 +級 ++級 +++級Groups Level- Level+ Level++ Level+++正常組Normal group 10 0 0 0模型組Model group 0 0 2 8痔瘡磁化膏組Hemorrhoid magnetized cream group 1 6 3 0馬應龍麝香痔瘡膏組Ma Yinglong musk hemorrhoids cream group 0 3 5 2

2.3 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠血清炎性細胞因子的影響

與正常組相比,模型組小鼠血清炎癥細胞因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量均顯著升高(P＜0.05);與模型組相比,痔瘡磁化膏組及馬應龍麝香痔瘡膏組小鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量均顯著降低(P＜0.05);與馬應龍麝香痔瘡膏組相比,痔瘡磁化膏組小鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量更低,但沒有顯著的統計學差異。 見表4。

2.4 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠血清NO 的影響

與正常組相比,模型組小鼠血清NO 含量顯著升高(P＜0.05);與模型組相比,痔瘡磁化膏組及馬應龍麝香痔瘡膏組小鼠血清NO 含量顯著降低(P＜0.05);與馬應龍麝香痔瘡膏組相比,痔瘡磁化膏組小鼠血清NO 含量更低,具有顯著的統計學差異(P＜0.05)。 見表5。

表4 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平的影響( ±s,n = 10)Table 4 Effect of hemorrhoid magnetized cream on IL-6, IL-1β and TNF-α level in the hemorrhoid mice( ±s,n = 10)

表4 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平的影響( ±s,n = 10)Table 4 Effect of hemorrhoid magnetized cream on IL-6, IL-1β and TNF-α level in the hemorrhoid mice( ±s,n = 10)

注：與正常組相比,?P＜0.05,??P＜0.01;與模型組相比,#P＜0.05,##P＜0.01;與痔瘡磁化膏組相比,&P＜0.05。Note. Compared with the normal group, ??P ＜0.01. Compared with the model group, #P ＜0.05, ##P ＜0.01. Compared with the hemorrhoid magnetized cream group, &P ＜0.05.

分組Groups IL-6(pg/mL) IL-1β(pg/mL) TNF-α(pg/mL)正常組Normal group 210.46±28.76 117.21±23.16 190.41±30.16模型組Model group 342.41±32.27?? 165.27±25.45?? 273.45±29.81??痔瘡磁化膏組Hemorrhoid magnetized cream group 257.13±23.62## 122.18±23.19# 221.16±20.34#馬應龍麝香痔瘡膏組Ma Yinglong musk hemorrhoids cream group 298.91±30.25#& 135.35±24.41# 232.56±23.42#

表5 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠血清NO 的影響( ±s,n = 10)Table 5 Effect of hemorrhoid magnetized cream on NO level in the hemorrhoid mice( ±s,n = 10)

表5 痔瘡磁化膏對痔瘡小鼠血清NO 的影響( ±s,n = 10)Table 5 Effect of hemorrhoid magnetized cream on NO level in the hemorrhoid mice( ±s,n = 10)

注：與正常組相比,??P＜0.01;與模型組相比,#P＜0.05;與痔瘡磁化膏組相比;&P＜0.05。Note. Compared with the normal group,??P ＜0.01. Compared with the model group, #P ＜0.05, ##P ＜0.01. Compared with the hemorrhoid magnetized cream group, &P ＜0.05.

分組Groups NO(μmol/L)正常組Normal group 79.76±6.61模型組Model group 128.46±7.83??痔瘡磁化膏組Hemorrhoid magnetized cream group 85.31±6.65##馬應龍麝香痔瘡膏組Ma Yinglong musk hemorrhoids cream group 104.81±6.27#&

3 討論

痔瘡發生的根本原因在于直腸末端黏膜下及肛管皮膚下靜脈叢屈曲導致柔軟靜脈團形成[2]。中醫學認為,痔瘡多為肛周氣滯不行、血瘀阻絡導致濕熱內生而成[10],治療時宜以清熱燥濕止痛、化瘀消腫止血為主。 中醫物理方法治療痔瘡歷史悠久,因其可以直接作用于患病部位,快速、有效地發揮治療效應,且毒副作用小、使用方便,現已成為臨床治療痔瘡的重點方案。

痔瘡發病的一個重要原因是炎癥水平異常,其中細胞因子在其中發揮著核心作用。 IL-6、IL-1β、TNF-α 在血清中表達增高與炎癥破壞及炎癥反應的嚴重程度呈正相關[11],這些炎癥細胞因子可誘導局部炎癥細胞浸潤及組織損傷。 炎癥是機體創傷后的基本防御反應,炎癥因子含量的高低可以反映炎癥的嚴重程度。 IL-6、IL-1β 和TNF-α 均是臨床常用的炎癥指標,常用作評價痔瘡治療后炎癥反應程度的重要指標[12]。 本研究發現,小鼠用20%醋酸造模13 d 后,血清IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平明顯升高,直腸局部組織粘膜缺損,表面有大量炎性細胞浸潤及組織壞死,并伴有肉芽組織形成,病理分級多處于++級和+++級;同時,模型小鼠血清NO 水平明顯升高,NO 作為重要的第二信使,是內源性血管緊張因子,廣泛參與調節血液循環、血小板活性、神經傳遞、免疫和炎癥等眾多病理生理過程。

痔瘡磁化膏是由遠紅外基材粉末、磁石粉及釹鐵硼磁鐵片、羊毛脂等成分混合而成的磁化膏。

研究發現,皮膚受到遠紅外輻射刺激之后,神經把該刺激傳遞到大腦,使植物性神經活躍、內分泌腺活動增強,引起血管擴張,加快血流速度,增強身體抵抗力,產生松軟組織、鎮痛、消炎、增強抵抗力的作用。 遠紅外基材粉末能夠吸收人體自身輻射的能量并直接發射遠紅外線光波,改善微循環,增強機體細胞活力,加強代謝作用,可用于急慢性損傷、發炎、疼痛等癥的治療[13],提示其在痔瘡的治療中具有潛在的開發價值。

釹鐵硼為著名的磁王,“磁”即磁石,為傳統中藥。 我國用磁石治病已有悠久歷史。 漢代司馬遷《史記·扁鵲倉公列傳》記載“磁石”具有磁性并可治療疾病;《本草綱目》、《中藥大辭典》等典籍中,多有用磁治病的記載。 “磁療法”早已被醫務界普遍采用,它可引起人體神經、體液代謝等一系列變化,具有活血化淤、消腫止痛、消炎、鎮痛等作用。 2011 年5 月11 日,國家食品藥品監督管理總局發布的《磁療產品注冊技術審查指導原則》提出,“磁場可以調節體內生物磁場、產生感應微電流、改變細胞膜通透性、改變某些酶的活性和擴張血管、加速血流,從而達到如止痛、消腫等治療作用。”中醫外治法治療痔瘡,將藥物外敷,憑借該部位對藥物進行吸收,再經過經絡的作用,使藥氣直達病所,達到消炎、鎮痛、止血、收斂、活血、化瘀等功效[14]。 同時,中醫用磁石治療痔瘡有著悠久的歷史,顧世澄所著《瘍醫大全》就提出,治療痔瘡時,可用“喚痔散(磁石、草烏、枯礬、干姜)”使內痔外脫、再用“枯痔草(如明礬、輕粉、朱砂等)”涂之,以消其痔[15],這提示痔瘡磁化膏中的磁石可能對痔瘡的治療具有良好的功效。

羊毛脂為羊毛上附著的一種脂肪,含膽固醇和羥膽固醇及三萜類和其脂肪醇,對皮膚無不良作用,是優良的潤膚基質,易被皮膚吸收,具有良好的潤滑作用,并具有減輕疼痛,促進傷后愈合作用[16]。

痔瘡磁化膏將遠紅外和磁場治療相結合,充分發揮其持續消炎消腫止痛、加快組織再生的功效,并以羊毛脂為潤滑劑,更有利于有效成分的作用。研究結果表明,痔瘡模型小鼠用痔瘡磁化膏治療11 d 后,肛周大便干枯、便血、肛門潮濕、肛周腫脹、肛周潰瘍及肛門瘀斑評分明顯降低,直腸組織病理學明顯減輕,炎癥細胞浸潤明顯減少,特別是在組織病理學指標上,其病變程度分級優于臨床常用的馬應龍麝香痔瘡膏。 同時,血清生化檢測發現,痔瘡磁化膏組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 和NO 水平顯著降低,這與遠紅外和磁場治療發揮抗炎作用的臨床效果相符。

痔瘡磁化膏應用于痔瘡治療領域,進一步豐富了遠紅外和磁場的臨床使用范圍,實驗表明,痔瘡磁化膏具有明顯的抗炎效應,為痔瘡磁化膏治療痔瘡的臨床應用提供了作用機制的理論基礎。