促黃體素對綿羊卵母細胞體外成熟及卵裂的影響

李 娜 趙建清 黃 飛 袁 水 方 翟 高慶華，3*

(1塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

（2塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300）

（3 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

在動物體內優勢卵泡成熟前LH 峰（LH surge）激增促使卵泡成熟并排卵，Dieleman 等[1]利用活體采卵技術（OPU，ovum pick-up）采集出現LH 峰后優勢卵泡中的卵母細胞，其囊胚率和活胚率均高于未出現LH 峰卵泡中的卵母細胞。張美佳等[2]研究發現維持減數分裂阻滯關鍵化合物為環腺苷酸（cAMP，cyclic adenosine monophosphate）和環鳥苷酸（cGMP，cyclic guanosinc monophosphate），cAMP 水平降低會引起卵母細胞過早成熟導致其成熟和排卵不同步，影響卵母細胞受精能力。PDE3A 是卵母細胞特異表達的磷酸二酯酶（phosphodiesterases），能被LH 激活，從而下調卵母細胞中的cAMP 水平，啟動卵母細胞的成熟。LH 峰到來之前，來源于顆粒細胞的cGMP，通過縫隙連接到達卵母細胞內，抑制了卵母細胞內PDE3A 的活性，將卵母細胞成熟和排卵調至同步狀態。Younis等[3]提出LH 能促進卵母細胞的成熟，孔祥敏等[4]認為在促排卵周期中，LH水平較高時，能夠獲得較高的卵子數，提高獲卵率，對臨床妊娠率也是一種幫助。Okazaki等[5]研究了含有FSH 的成熟培養基中添加LH能夠上調顆粒細胞cAMP 水平刺激孕酮的分泌，分泌的孕酮能夠減少顆粒細胞增殖活性，加速減數分裂恢復。李凱等[6]認為LH 延遲生發泡破裂（GVBD，germinal vesicle breakdown）的同時，促進卵母細胞胞質成熟，使綿羊卵母細胞的核質成熟趨于同步，有助于綿羊卵母細胞的體外成熟以及受精后進一步的發育。Blondin 等[7]在奶牛超數排卵方案中于取卵前6 h對一半的母牛注射LH，OPU后發現注射LH雖未改變卵泡的大小但顯著提高了體外胚胎培養的胚胎發育率及囊胚率。目前LH 對綿羊卵裂后胚胎發育作用的研究較少，且大多數研究者認為LH 的添加濃度在5～20 μg/mL 時，能獲得較高的卵母細胞成熟率，但LH的最適添加濃度并沒有得到統一[8-10,15]。本試驗在TCM199成熟基礎培養液中分別添加5個濃度梯度的LH，比較不同濃度的LH 對綿羊卵母細胞的成熟率、受精率以及卵裂率的影響，以確定LH 的最適添加濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

促卵泡素（FSH）購自Reprobiol 公司，肝素鈉、促黃體素（LH）購自索萊寶，SOF液購自Caisson公司，胎牛血清（FBS）、雙抗（PS）、TCM199 培養基購自Giboc公司，昆侖一號精液稀釋液購自塔克藍公司，其余藥品均購自Sigma公司。

1.1.2 試劑配制

卵巢運輸液1 L：9 g NaCl+0.1 g（100 mg/L）青霉素+0.1 g（100 mg/L）鏈霉素。

采卵液1 L：9. 5 g TCM199 粉（9. 5 g/L）+0. 42 g NaHCO3（5 mM）+2. 383 g HEPES（10 mM）+2. 603 g HEPES-Na（10 mM）+0. 01 g 肝素鈉（10 mg/mL）+10 ml FBS（1%）+10 ml PS（1%）

卵母細胞基礎成熟培養液100 ml：TCM199 培養基90 ml+200 μL 5 mg/L FSH 濃儲液終濃度（10 μg/mL）+10 ml FBS（10%）+ 20 μL 10 mg/L E2濃儲液終濃度（2 μg/mL）+1 ml PS（1%）+0. 022 g 丙酮酸鈉（2 mM）+0.5 ml 200 mM L-谷氨酰胺（1 mM）+0.0024 g L-胱氨酸（100μM）

配制不同濃度LH 的卵母細胞成熟液：卵母細胞基礎成熟培養液（0μg/mL）中LH的添加濃度分別為：5、10、15、20μg/mL

0. 1% 透明質酸酶：0. 1 g 透明質酸酶+100 mL PBS

精 子 獲 能 液10 ml：8 ml SOF 液+ 2 ml FBS（20%）+0. 01 g 肝素鈉（10 mg/mL）+0. 0044 g 乳酸鈣（2 mM）

受精液10 ml：8 ml SOF 液+ 2 ml FBS（20%）+0.005 g肝素鈉（5 mg/mL）+0.0011 g乳酸鈣（0.5 mM）

胚胎培養液10 ml：10 ml SOF 液+0. 1 ml NEAA（1%）+0. 2 ml EAA（2%）+0. 005 g 肌醇（2. 77 mM）+0. 05 ml 200 mM L-谷氨酰胺（1 mM）+0. 06 g BSA（6 mg/mL）+0. 0004 g 葡萄糖（0. 25 mM）+0. 1 ml PS（1%）

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養箱（型號：MC0-15A），日本三洋公司制造；高壓滅菌鍋（型號：SX-500），日本TOMY 公司制造；倒置熒光顯微鏡（型號：TS100-FNikon），尼康公司制造；超凈工作臺（SWCJ-2FD），博訊公司制造；臺式高速冷凍離心機（型號：Sigma 3K30），Sigma公司制造。

1.2 方法

1.2.1 離體卵巢采集

綿羊卵巢采自阿克蘇市屠宰場。阿克蘇地區成年母羊屠宰后立即取下雙側卵巢，用75%乙醇噴洗，放入37 ℃滅菌（加雙抗）生理鹽水中2～3 h 內運回實驗室。

1.2.2 卵丘-卵母細胞復合體（COCs）采集

采用切割法收集卵母細胞。采集發情季節綿羊卵巢，用75%乙醇快速清洗3 遍，37 ℃無菌生理鹽水中清洗3遍。在無菌培養皿中，用手術刀片劃破卵泡后用裝有采卵液的注射器沖洗卵泡腔，使卵母細胞流入采卵液中。沉淀數分鐘，在體式顯微鏡下撿卵[11]。

1.2.3 COCs選擇

在體視顯微鏡下選擇A、B 級COCs 進行成熟培養。A級卵母細胞要求有顆粒細胞3層以上，且緊密包圍卵母細胞顆粒細胞擴張充分；B 級要求卵母細胞胞質均勻，顆粒細胞少于等于3層大于2層。

1.2.4 COCs成熟培養

采用微滴培養法。在無菌環境下制作成熟培養微滴，將挑選A、B 級COCs 用IVM 液清洗3 遍轉入預先平衡好的微滴中，每個微滴放入30 枚COCs。在二氧化碳恒溫培養箱中以5%CO2、38.5 ℃、飽和濕度培養24 h，觀察卵丘的擴散，并做好記錄。

1.2.5 觀察第一極體排出情況

成熟培養24 h 用自制口吸管將COCs 轉移至含0.1%透明質酸酶的PBS 中，200μL 移液槍反復吹打至COCs 周圍顆粒細胞脫落露出透明帶，在IVF 液中洗三遍，放置體視鏡下用細玻璃管撥動卵母細胞觀察第一極體排出情況，記錄排出第一極體的卵母細胞數。

1.2.6 顆粒細胞培養

用胚胎發育液在35 mm 培養皿中制作70 μL的微滴（石蠟油覆蓋，CO2培養箱中平衡2 h 以上）。將透明質酸酶脫離的顆粒細胞接種至微滴中，在38.5 ℃、5% CO2、100%濕度的二氧化碳恒溫培養箱中培養。

1.2.7 精子上游

電刺激采集綿羊精液，1:4的比例添加稀釋液，按照昆侖一號說明書操作步驟進行稀釋。取0.5 mL稀釋精液緩慢注入含1 mL 精子獲能液的離心管底部，傾斜45°，置于38.5 ℃、5%CO2、100%濕度的恒溫培養箱內孵育30 min，取上清液1 mL，800 ×g 離心5 min，棄上清液，重復一次。

1.2.8 體外受精

脫去顆粒細胞的成熟卵母細胞，用受精液清洗3次后放入50μL 覆蓋有石蠟油的受精液微滴中，單個微滴最多15 枚COCs。取上游精液加入受精微滴中（精子密度大約為1×106個/mL），在38.5 ℃、5%CO2、100%濕度的二氧化碳恒溫培養箱中精卵共孵18 h。

1.2.9 胚胎體外培養

預先平衡70μL 胚胎發育液，將受精后的受精卵放入胚胎發育液中洗掉周圍精子后放入發育液中，顆粒細胞與受精卵于CO2恒溫培養38.5 ℃、5%CO2、100%濕度共孵，24 h記錄卵母細胞卵裂數。每隔2 d進行一次半量換液，胚胎發育第4 d 解除顆粒細胞與胚胎共孵培養，144 h統計桑椹胚的數量。

1.2.10 統計分析

每個試驗組都重復3次，所有數據采用SPSS17.0統計軟件的單因素方差分析進行顯著性檢驗，LSD多重比較差異，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準，結果用平均值±標準差表示。

成熟率=成熟COCs總數/COCs總數×100%

卵裂率=卵裂卵母細胞總數/成熟COCs總數×100%

桑椹胚率=桑椹胚總數/成熟COCs×100%

2 結果與分析

2.1 不同濃度LH對COCs成熟率的影響

本試驗將卵丘擴散疏松（如圖1-A 所示），第一極體排出胞質均勻的COCs（如圖1-B 所示），記為成熟COCs。不同濃度LH 成熟培養液中成熟情況見表1。由表1 可見，C 組COCs 的成熟率顯著高于其它組（P＜0.05），B、D、E 組COCs 的成熟率差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同濃度的LH 對COCs成熟率的影響

2.2 不同濃度LH對卵裂率的影響

成熟卵母細胞卵裂率見表2。由表2 可見，C 組培養成熟的COCs 其卵裂率顯著高于其它各組（P＜0.05），B、D、E各組間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同濃度的LH對卵裂率的影響

2.3 不同濃度的LH對桑葚胚率的影響

桑椹胚見圖2-C，卵裂后桑椹胚發育情況見表3。由表3 可見，C 組培養成熟的COCs 顯著高于其它各組（P＜0.05），D、E組間無顯著差異（P＞0.05）。

表3 不同濃度的LH對桑葚胚率的影響

圖1 卵母細胞成熟

圖2 桑椹期胚胎

3 討論

Figueiredo 等[12]認為小于8 mm 的牛卵泡中，顆粒細胞只表達FSHR mRNA ，而沒有LHR mRNA 表達，故單獨添加不同濃度的LH 不能提高卵母細胞的成熟。但Fu 等[13]利用RT-PCR 及原位雜交技術發現FSH 刺激的卵母細胞減數恢復與顆粒細胞上的LHR mRNA 表達密切相關，單獨添加LH 對小鼠卵母細胞減數分裂起始無影響。胡艷明等[14]在成熟培養液中單獨添加10μg/mL 的LH 時，延邊黃牛卵母細胞體外成熟率和卵裂率分別為80. 6%和79. 8%，其成熟率顯著高于添加0 μg/mL、5 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL，與本試驗含10 μg/mL FSH 添加10 μg/mL LH 所得成熟率76. 60%基本相近。本試驗基礎成熟液中含10 μg/mL 的FSH，結果表明添加10 μg/mL 的LH，卵母細胞的成熟率最高且顯著高于其他添加濃度，而成熟率的提高是否與LHR mRNA 的表達相關需要進行分子試驗驗證。FSH和LH在卵母細胞成熟過程中具有協同作用，本試驗未探究FSH 和LH 添加比例對卵母細胞成熟的影響，僅在添加10 μg/mL FSH 的基礎上添加不同濃度的LH，王娟等[15]在灘羊卵母細胞成熟培養時同時添加40 μg/mL LH 和200 μg/mL FSH 成熟率達到68.8%，FSH 和LH 的添加濃度均高于本試驗10μg/mL LH 和10μg/mL FSH，原因可能是激素的生產廠家不同其純度會有所差異，使得激素的添加濃度差異較大。楊恕玲等[16]認為20μg/mL LH是灘羊卵母細胞體外成熟的最佳添加劑量，較本試驗得出10 μg/mL 最佳添加劑量較高，原因可能是阿克蘇地區綿羊與灘羊品種不同。潘文平等[17]在山羊卵母細胞體外成熟培養試驗中用LH 處理后卵母細胞成熟率顯著高于未添加組。因此，添加LH 能提高COCs 的成熟、卵裂率及桑椹胚率。且本試驗結果表明添加10μg/mL LH 能顯著提高卵母細胞成熟率、卵裂率及桑椹胚率。

Chebrout 等[18]認為顆粒細胞的擴散程度能夠反映出卵母細胞的成熟情況。孫桂金[19]和周佰成[20]認為10 μg/mL FSH/LH 為綿羊卵母細胞體外成熟的最適添加濃度，與本試驗最適添加濃度一致，但在孫桂金[19]的試驗中綿羊卵母細胞的成熟率為68.60%，與本試驗成熟率（77.71%）相比較低，其原因可能是采集的卵母細胞質量不同而造成的差異。李凱等[6]添加10μg/mL 的LH 時綿羊的卵裂率顯著高于對照組，與本試驗結果一致。衛恒習[8]認為添加LH 對綿羊的卵裂率無明顯作用，造成差異的原因可能是：一是成熟培養液中其他添加物質不相同，二是成熟卵母細胞的質量和精子活力造成差異。LH能夠提高卵母細胞的受精率和卵裂率，原因是LH 具有暫時性抑制生發泡的破裂，延遲卵母細胞核成熟的作用，使卵母細胞有更長的時間來完成胞質成熟[21]，LH 同時關閉卵母細胞和顆粒細胞之間的縫隙連接，使卵母細胞從減數分裂抑制的狀態中解除出來[22]。卵母細胞的成熟質量決定著后期受精和胚胎發育情況。

4 結論

在含有10 μg/mL FSH 的TCM199 成熟培養液中添加10μg/mL LH 的綿羊卵母細胞的成熟率、受精率和卵裂率均顯著高于其他添加組（P＜0. 05）。LH 濃度為10μg/mL 時對綿羊卵母細胞體外成熟及受精發育效果最好。