貴州省小麥品種（系）中與籽粒硬度相關基因的分子檢測

楊夢晨 晏權 任明見 李魯華 徐如宏

摘 要：小麥Puroindoline基因與小麥籽粒硬度及其產量性狀密切相關。為揭示貴州省小麥品種（系）中與籽粒硬度相關基因的分布，本文利用小麥籽粒硬度基因Pina、Pinb和Pinb-2的3個特異性功能標記對140份小麥品種（系）進行分子標記檢測，旨在為遺傳育種中親本選擇提供參考。結果表明，在140份貴州小麥品種（系）中，Pina-D1和Pinb-D1基因位點Pina-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1a和Pinb-D1b等位變異的頻率分別為17.14%、25.00%、50.71%和21.43%;在Pinb-2位點上，10.00%的小麥品種含Pinb-2v2等位基因，87.86%的小麥品種含Pinb-2v3等位基因。3個位點基因型組合分析表明，在所檢測的貴州小麥種質中共有8種基因型組合，其中2種軟質麥基因型組合Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3;4種硬質麥基因型組合（Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3和2種混合型組合Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v2、Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v3），各組合分布頻率分別為0.71%、8.57%、0.71%、4.28%、3.57%、7.85%、0.71%和2.14%。研究結果可為貴州小麥籽粒硬度的遺傳改良提供參考。

關鍵詞：小麥;籽粒硬度;等位變異;分子標記

Abstract：Puroindoline gene was closely related to the kernel hardness and yield-related traits in wheat. In order to reveal the distribution of genes related to grain hardness in wheat cultivars （lines） in Guizhou Province， In this paper， specific function of three kernel gene Pina， Pinb and Pinb-2 markers was identified with molecular marker in total of 140 cultivars （lines）in order to provide reference for parent selection in genetic breeding. The results demonstrated that among the 140 wheatcultivars （lines） in Guizhou， the frequency of Pina-D1 and Pinb-D1 gene locus Pina-D1a， Pina-D1b， Pinb-D1a and Pinb-D1b alleles were 17.14% ，25.00%， 50.71% and 21.43%， respectively.At the Pinb-2 locus， 10.00% of the wheat cultivars contain the Pinb-2v2 allele， and 87.86% of the wheat cultivars contain the Pinb-2v3 allele. The analysis of genotype combinations at three locus showed that there were? eight genotype combinations in the tested wheat germplasm in Guizhou，including two soft wheat genotype combinations? （Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v2，Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3），four hard wheat genotype combinations （Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v2，Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3，Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v2，Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3） and two hybrid combinations （Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v2，Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v3），the distribution frequency of each combination is 0.71%，8.57%， 0.71%，4.28%，3.57%，7.85%，0.71% and 2.14%. The results could provide a reference for genetic improvement of grain hardness in Guizhou wheat.

Keywords：Guizhou wheat; grain hardness; allelic variation; molecular markers

目前，全球每年的小麥（Ttiticnm aestivum L.）產量大約為700萬噸[1]。籽粒硬度是小麥重要品質性狀之一[2]，根據小麥籽粒的硬度一般將小麥分為硬質麥和軟質麥兩類[3]。小麥籽粒硬度由位于5D染色體短臂上的Pina和Pinb基因[4-6]共同作用控制。當Pina和Pinb同為野生型（Pina-D1a/Pinb-D1a）時，籽粒為柔軟表型，兩者任何一個基因發生突變或缺失都會使籽粒變硬[7]。早期Pina和Pinb的鑒定大多采用SDS-PAGE電泳[8]，但Pina和Pinb的同源性高（約60%），分子量非常接近，用SDS-PAGE電泳很難區分，因此國內外學者相繼開發出了Pina和Pinb基因型的分子標記，如Pina-D1a[9]、Pina-D1b[10]、Pinb-D1a和Pinb-D1b[11]等。陳鋒等[12]通過籽粒硬度測定，隨機選取了10個中國冬小麥軟質麥品種進行了分子標記檢測，結果表明其Pina和Pinb基因均為野生型，即Pina-D1a/Pinb-D1a，基因型與表型相符，證明已開發的分型標記可靠。王化敦等[13]測定了105份小麥的籽粒硬度，得出了40份硬質麥，再通過分子標記檢測，發現它們是Pina蛋白缺失類型（即Pina-D1b/Pinb-D1a和Pina-D1b/Pinb-D1b），證實了已開發的籽粒硬度基因分子標記特異性強、準確性高。因此，上述研究中開發的功能標記已經能夠對Pina和Pinb的多種類型進行有效鑒定。

近年來，與Pinb序列高度相似（約60%）的Pinb-like genes（也稱為Pinb-2）基因與表型的相關性成為了研究熱點[14]。Chen等[15]設計了Pinb-2的特異引物，得出Pinb-2v2和Pinb-2v3互為一對位于7B的等位基因。研究表明，Pinb-2v3變異類型的小麥品種在千粒重、小穗數、粒長、粒寬和等性狀略高于Pinb-2v2[16];具Pinb-2v3的小麥品種與具有Pinb-2v2的小麥品種相比，有更高的籽粒硬度和更好的籽粒性狀[17]。

目前，對貴州小麥材料Pina、Pinb、Pinb-b2基因分布的研究未有報道，鑒于Puroindoline基因與小麥品質性狀和產量性狀密切相關，且目前已開發的功能標記已經能夠對Puroindoline各類型進行有效鑒定。本研究以3個籽粒硬度基因（Pina、Pinb和Pinb-b2）的特異性功能標記對140份貴州小麥品種（系）進行了分子標記檢測，旨在為今后研究不同Puroindoline基因型對小麥加工品質的影響作用提供依據，進而有助于貴州小麥籽粒硬度的改良。

1 材料與方法

1.1 材料

材料：貴紫1號、貴農19、貴綠、黔育21、貴麥14、興育89等140份貴州小麥品種（系），由國家小麥改良中心貴州分中心提供。材料名稱及來源見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取小麥幼苗葉片0.2g左右，采用改良CTAB法提取基因組DNA[18]。用Genova Nano型核酸蛋白檢測儀（英國Jenway）檢測DNA濃度后，稀釋至100ng/μL，在4℃冰箱保存備用。

1.2.2 PCR擴增

提取后的基因組DNA在BIO-RAD T100_Thermal Cycler上進行PCR擴增，反應體系為20μL，以100ng小麥材料DNA為模板，1UTaq DNA Polymerase，10pmol的上游、下游引物，0.2mmol/L dNTP，10×PCRBuffer（含20mmol/L Tris-HCL（pH8.4）、20mmol/LKCL），25mmol/LMgCl2，剩下的用ddH2O補充至20μL。試驗所需試劑購置于北京天根生化科技有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應特異性引物的序列及具體反應程序見表2。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測及結果統計

PCR擴增產物用濃度為1.0%～1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析，所用緩沖溶液為0.5×TAE，在100～130V電壓下電泳40～50min，用蒸餾水漂洗1min后，用UVP凝膠分析系統觀察、照相并記錄。

統計方法：根據每個材料的檢測結果判斷該品種Pina、Pinb和Pinb-2基因位點的等位變異類型，僅對PCR產物條帶清晰、單一并符合目標條帶大小的對進行統計。

2 結果與分析

2.1 貴州小麥品種（系）Pina基因等位變異分布頻率

利用引物Pina-D1a和A-Null對供試小麥材料進行分子標記檢測，分別能擴增出大小為447bp和326bp的片段，對應的等位變異類型為Pina-D1a和Pina-D1b（圖1、2）。140份貴州小麥材料Pina位點的檢測表明（表3），分枝麥5號、貴麥2號、豐優48-5、貴農優質麥、節普1號等24份材料擴增出447bp的目標條帶，是Pina-D1a類型等位變異;貴紫1號、興育89、貴麥1號、R21-2等35份材料擴增出326bp的目標條帶，是Pina-D1b類型等位變異;其他材料未擴增出任何條帶，即未含Pina-D1a和Pina-D1b基因的類型。在Pina位點，140份貴州小麥品種（系）中的優勢等位變異為Pina-D1a類型，占比25.00%。

2.2 貴州小麥品種（系）Pinb基因等位變異分布頻率

利用引物Gly和Ser對供試小麥材料進行分子標記檢測，均能擴增出大小為240bp的片段，對應的等位變異類型為Pinb-D1a和Pinb-D1b（圖3、4）。140份貴州小麥材料Pinb位點的檢測表明（表3），豐優5號、貴農19無芒、豐優48-5、貴農28-1、等71份材料擴增出240bp的目標條帶，是Pina-D1a類型等位變異;貴麥9號、貴麥2號、貴農25-1、安2014-4等30份材料擴增出240bp的目標條帶，是Pinb-D1b類型等位變異;其他材料未擴增出任何條帶，即未含Pinb-D1a和Pinb-D1b基因的類型。在Pinb位點，140份貴州小麥品種（系）中的優勢等位變異為Pinb-D1a類型，占比50.71%。

2.3 貴州小麥品種（系）Pinb-2基因等位變異分布頻率

利用引物Pinb-2v2和Pinb-2v3對供試小麥材料進行分子標記檢測，分別能擴增出大小為401bp和398bp的片段，對應的等位變異類型為Pinb-2v2和Pinb-2v3（圖5、6）。140份貴州小麥材料Pinb-2位點的檢測表明（表3），豐優5號、豐優8號、貴農25-1、興育89等14份材料擴增出401bp的目標條帶，是Pinb-2v2類型等位變異;貴農35、石無芒、張07-8、貴農22等123份材料擴增出398bp的目標條帶，是Pinb-2v3類型等位變異;其他材料未擴增出任何條帶，即未含Pinb-2v2和Pinb-2v3基因的類型。在Pinb-2位點，140份貴州小麥品種（系）中的優勢等位變異為Pinb-2v3類型，占比87.86%。

2.4 貴州小麥品種（系）Pina、Pinb和Pinb-2多個位點等位變異分布頻率

在140份貴州小麥品種（系）中，Pina、Pinb和Pinb-2基因位點Pina-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1a、Pinb-D1b、Pinb-2v2和Pinb-2v3等位變異的頻率分別為17.14%，25.00%，50.71%，21.43%，10.00%和87.86%。組合分析表明，140份貴州小麥品種（系）中共存在8種不同等位變異組合，即Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v2和Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v3，分布頻率分別為0.71%，8.57%，0.71%，4.28%，3.57%，7.85%，0.71%和2.14%（表4）。

3 結論與討論

小麥籽粒硬度對出粉率、面粉顆粒大小和面制品加工品質影響很大，是重要的小麥品質性狀之一[20]，明確小麥籽粒硬度基因Pina、Pinb和Pinb-2的等位變異類型分布特點，對于小麥品質改良具有重要意義。劉紅美[21]、張晶[22]等發現黃淮麥區小麥核心種質和陜西小麥中的軟質麥占比較低，硬質麥占比較高，硬質麥主要由Pinb-D1b基因型組成;國外的小麥品種（系）也以硬質麥為主[23-24]。而陳鋒等[25]發現硬質小麥材料在西南地區的分布頻率較低，李式昭等[26]的研究也表明，四川小麥品種中硬質麥占比較少。經檢測，本試驗140份供試的小麥品種（系）中Pina-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1a和Pinb-D1b等位變異的頻率分別為16.46%，25.32%，50.00%和21.52%，據此可分出籽粒硬質33份，軟質13份，表明貴州小麥品種（系）中20.89%為硬質材料，8.23%為軟質品種。其中，籽粒硬質及軟質的小麥品種都較少，這一點與黃淮麥區和國外小麥的研究結果不同，與李式昭和陳鋒等[26-27]的研究基本一致，小麥品種籽粒硬度分布的差異可能是自然地理環境和選育品種所選用的親本資源不同所致。

Puroindoline基因的類似基因Pinb-2對食品加工品質和產量性狀都有影響[27]。研究表明，具有Pinb-2v3等位變異類型的小麥品種其千粒重、籽粒直徑、穗粒數、穗粒重和單株粒重等產量性狀都較好[28]，且Pinb-2v3等位變異在國內外小麥品種中分布廣泛[19，29，30]。本試驗中，有124份材料檢測出了Pinb-2v3，占比88.61%，Pinb-2v3具有很高的分布頻率，與前人的研究一致。這可能是由于含Pinb-2v3的小麥材料其產量性狀表現較為優異，育種家們在育種過程中不經意的選擇了攜帶該基因的品種，致使大部分研究的調查品種中Pinb-2v3基因型最常見。對140份貴州小麥品種（系）的Pina、Pinb和Pinb-2多個位點基因型分布進行組合分析，得出2種軟質麥基因型組合和4種硬質麥基因型組合。值得注意的是，組合Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3和Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3，在140份供試材料中作為優勢組合的同時還含有與高千粒重相關的Pinb-2v3基因，今后可優先考慮利用具這些組合的材料進行貴州小麥品質育種的研究。

相較其他地區，貴州小麥品種（系）中，硬質、軟質以及與高千粒重相關的品種較少，這進一步說明了貴州小麥品種在品質改良方面還有很大的提升空間。因此，本研究明確了140份貴州小麥品種（系）籽粒硬度的基因型，可為今后這些貴州小麥品種（系）籽粒硬度的改良和產量的提高提供幫助。

參 考 文 獻：

[1] 張秀青.全球糧食市場形勢、異動風險及應對措施——基于保障國家糧食安全的國際視角分析[J].價格理論與實踐，2020（5）：4-8.

[2] 鄭雅月，趙振杰，趙萬春，等.小麥籽粒硬度研究進展[J].麥類作物學報，2017，37（7）：915-922.

[3] 王雪玲，李建民，魏樂，等.青海小麥籽粒硬度等位變異研究[J].麥類作物學報，2014，34（1）：23-27.

[4] SOURDILLE P， PERRETANT M R， CHARMET G，et al. Linkage between RFLP markers and genes affecting kernel hardness in wheat[J].Theoretical and applied genetics，1996，93（4）：580-586.

[5] 陳鋒，李根英，耿洪偉，等.小麥籽粒硬度及其分子遺傳基礎研究回顧與展望[J].中國農業科學，2005（6）：1088-1094.

[6] QAMAR Z U， BANSAL U K， Dong C M，et al. Detection of puroindoline （Pina-D1 and Pinb-D1） allelic variation in wheat landraces[J].Journal of cereal science，2014，60（3）：610-616.

[7] 姚金保，周淼平，馬鴻翔，等.小麥籽粒硬度的遺傳分析[J].江蘇農業學報，2018，34（4）：721-725.

[8] 岳淑芳.小麥籽粒硬度及其Pinb-D1a和Pinb-D1b基因分子標記研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2007.

[9] GAUTIER M F， ALEMAN M E， GUIRAO A，et al. Triticum aestivumpuroindolines， two basic cystine-rich seed proteins： cDNA sequence analysis and developmental gene expression[J].Plant molecular biology，1994，25（1）：43-57.

[10] GIROUX M J， MORRIS C F. A glycine to serine change in puroindoline b is asssociated with wheat grain hardness and low levels of starch-surface friabilin[J].Theoretical and applied genetics，1997，95（5-6）：857-864.

[11] CHEN F， ZHANG F Y， MORRIS C F，et al.Molecular characterization of the puroindoline a-D1b allele and development of an STS marker in wheat （Triticum aestivum L.）[J].Journal of cereal science，2010，52（1）：80-82

[12] 陳鋒.中國和CIMMYT普通小麥puroindoline基因分子基礎研究及其對加工品質的影響[D].北京：中國農業科學院，2006.

[13] 王化敦，高春蕾，張鵬，等.長江中下游麥區小麥品種籽粒硬度及puroindoline基因等位變異的分子檢測[J].麥類作物學報，2017，37（4）：438-444.

[14] 李小燕.Puroindoline基因與小麥籽粒硬度關系研究[D].武漢：華中科技大學，2019.

[15] CHEN F， XU H X， ZHANG F Y，et al. Physical mapping of puroindoline b-2 genes and molecular characterization of a novel variant in durum wheat （Triticum turgidum L.）[J].Molecular breeding，2011，28（2）：153-161.

[16] 張福彥，陳鋒，董中東，等.黃淮麥區小麥新品系籽粒硬度相關基因分子鑒定及其對產量性狀的影響[J].中國農業科學，2011，44（16）：3289-3296.

[17] CHEN F， ZHANG F， CHENG X，et al. Association of Puroindoline b-B2 variants with grain traits， yield components and flag leaf size in bread wheat （Triticum aestivum L.） cultivars of the Yellow and Huai Valleys of China[J].Journal of cereal science，2010，52（2）：247-253.

[18] 思彬彬，張超，徐如宏，等.小麥基因組DNA改良提取方法的探討[J].山地農業生物學報，2005，24（2）：142-145.

[19] 李向楠.小麥籽粒硬度相關基因的鑒定及其與產量品質性狀的關聯分析[D].鄭州：河南農業大學，2014.

[20] 徐晶晶.青海省育成小麥品種（系）資源的分子評價[D].西寧：青海大學，2017.

[21] 劉紅美，祝梓博，田秋珍，等.中國黃淮麥區小麥籽粒硬度Puroindoline基因等位變異檢測[J].分子植物育種，2016，14（10）：2700-2715.

[22] 張晶，張曉科，王可珍，等.陜西小麥籽粒硬度及其基因型分析[J].麥類作物學報，2011，31（4）：666-671.

[23] 劉東軍，張宏紀，郭長虹，等.俄羅斯小麥籽粒硬度及puroindoline基因等位變異的分布[J].核農學報，2015，29（5）：836-842.

[24] 楊保安，張建偉，張福彥，等.81份國外小麥品種（系）Puroindoline基因分子鑒定與分析[J].核農學報，2014，28（5）：817-824.

[25] 陳鋒，錢森和，張艷，等.中國冬小麥puroindoline類型分布及其對溶劑保持力的影響[J].中國農業科學，2005（11）：30-38.

[26] 李式昭，鄭建敏，伍玲，等.四川小麥品種籽粒硬度和穗發芽抗性相關基因的分子標記鑒定[J].西南農業學報，2018，31（4）：641-645.

[27] RAPP M，SIEBER A，KAZMN E.et al.Evaluation of the genetic architure and the potential of geno mics-assisted breeding of quality traits in two large panels of durum wheat[J].Theoretical and applied genetics，2019，132（6）：1873-1886.

[28] 陳鋒，李向楠，曹瑩瑩，等.小麥Puroindoline b-2基因變異與產量相關性狀的分析[J].作物學報，2014，40（1）：17-21.

[29] 張福彥，陳鋒，張建偉，等.普通小麥中Puroindoline b-2基因的分子鑒定及表達分析[J].植物遺傳資源學報，2014，15（2）：342-347.

[30] 白璐，楊春艷，蘇秀娟，等.新疆小麥籽粒硬度Puroindoline b相關基因等位變異的分子檢測[J].分子植物育種，2017，15（3）：956-964.