九香蟲血淋巴不同保存溫度下的穩定性評價

趙帥 于梅 檀軍 蔡仁蓮 田瑩 郭建軍

摘 要：九香蟲是一種傳統藥用昆蟲，其血淋巴具有抗癌、抗菌作用，也可用以治療嬰兒血管瘤等，其抗癌活性物質主要為多肽。但九香蟲血淋巴在不同保存條件下穩定性較差，易產生不溶性沉淀，導致其總蛋白含量變化以及抗癌活性變動。本文通過對常規保存溫度（4、-20、-80℃）下的九香蟲血淋巴產生不溶性沉淀及總蛋白含量的測定，并通過體外MTT法，檢測不同處理的九香蟲血淋巴的體外抗癌活性，以評價九香蟲血淋巴的穩定性。結果顯示，-80℃下保存的血淋巴產生不溶性沉淀量相對較少，總蛋白含量在14d首次取出無顯著變化，不同處理的九香蟲血淋巴均能明顯抑制乳腺癌細胞的生長，-80℃抗癌活性相對穩定。綜上，-80℃溫度下較適合九香蟲血淋巴的保存。

關鍵詞：九香蟲;血淋巴;總蛋白;沉淀;抗癌活性

Abstract：Aspongopus chinensis is a traditional medicinal insect， and its hemolymph has anti-cancer and anti-bacterial effects. It can also be used to treat hemangioma etc. But A.chinensis hemolymph is less stable under different storage conditions， and it is easy to produce insoluble precipitation， which leads to changes in its total protein content and anti-cancer activity. In this paper， the total protein content and precipitation of the hemolymph under different temperatures （4，-20，-80℃） were observed continuously. The anti-cancer activity in vitro of the hemolymph with different treatments by MTT method， and the hemolymph stability of A.chinensis was evaluated. The results showed that the amount of insoluble precipitation produced by hemolymph was relatively small when stored at -80℃. Total protein content was not significantly changed when the hemolymph was first removed after 14 days. The hemolymph treated with different treatments could significantly inhibit the growth of breast cancer cells， and the anticancer activity was relatively stable at -80℃. To sum up， the temperature of -80℃ is more suitable for the preservation of hemolymph of A.chinensis.

Keywords：Aspongopus chinensis; hemolymph; total protein; precipitation; anti-cancer activity

九香蟲Aspongopus chinensis，為一味傳統中藥，始記載于《本草綱目》，主治膈脘滯氣，脾腎虧損，壯元陽，等。2015年版中國藥典，九香蟲以藥材和飲片類別寫入，具理氣止痛，溫中助陽功效。現代藥理學研究顯示，九香蟲血淋巴能顯著抑制人胃癌細胞SGC-7901、人乳腺癌細胞MCF-7的體外生長，并可誘導癌細胞凋亡[1-5]，同時臨床應用其可治愈血管瘤[6-7]，研究顯示其抑癌活性組分主要存在于血淋巴，主要抗癌活性物質為蛋白多肽類[8-9];Tan等[10]從九香蟲血淋巴中分離出一種穩定性較好的多肽類物質，耐高溫且抗癌活性良好。

筆者在試驗過程中發現，九香蟲血淋巴穩定性較差，易產生不溶性沉淀，從而引起總蛋白含量易發生變化和抗癌活性變動等問題。本研究通過測定不同儲存條件下九香蟲血淋巴的蛋白質含量及體外抗癌活性的變化，探討不同儲存條件下不溶性沉淀的產生對九香蟲血淋巴穩定性及抗癌活性的影響，以期為中藥材九香蟲血淋巴的進一步研究選擇保存方式提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蟲源

九香蟲采集于貴州省凱里市（E107.80°，N26.52°），清水清洗干凈后，保存于-80℃冰箱，備用.

1.1.2 癌細胞

4T1小鼠乳腺癌細胞購于中國科學院細胞庫，培養在RPMI-1640培養液中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養在細胞培養箱中，備用。

1.2 試驗試劑

RPIM-1640培養液和丙酮酸鈉溶液購于美國Gibco公司，0.25%胰酶購于美國HyClone公司，胎牛血清購買于浙江天杭生物科技股份有限公司，PBS緩沖液購于上海生工生物工程股份有限公司，青鏈霉素購于北京索萊寶科技有限公司，碳酸氫鈉（分析純）購于天津市永大化學試劑有限公司，葡萄糖（分析純）購于成都金山化學試劑有限公司，Bradford蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物購于上海碧云天生物技術有限公司，二甲基亞砜（DMSO）購于美國Amresco公司，噻唑藍（MTT）購于美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 九香蟲血淋巴的制備及保存

九香蟲去除頭、胸部，腹部置于5mL一次性針管中，物理按壓，得到九香蟲腹腔內容物;4℃，13000×g離心15min，取中間層暗紅色液體;4℃，10000×g離心10min，取上層液體得九香蟲血淋巴;加入蛋白酶抑制劑，0.45μm微孔濾膜除菌;濾出液即為九香蟲血淋巴，分別保存于4℃、-20℃（青島海爾股份有限公司，BCD-440WDPG）、-80℃冰箱（Thermo scientific，Forma 900 series）內備用。每個溫度下三個重復，記為4-1，4-2，4-3，-20-1，-20-2，-20-3，-80-1，-80-2，-80-3。

1.2.2 不同保存溫度下九香蟲血淋巴沉淀及總蛋白變化

九香蟲血淋巴4℃，10000×g離心10min，電子天平（上海卓精電子科技有限公司，BSM-520.3）稱量每次沉淀質量，上清液0.45μm微孔濾膜除菌后Bradford法測定總蛋白含量。具體方法為4-1、-20-1和-80-1在第2天首次從冰箱拿出，低溫離心取沉淀稱重，取血淋巴液體測定吸光度，根據Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書制作的蛋白標準曲線計算總蛋白含量，分別在6、14、21、28天重復上述操作計算沉淀重量和總蛋白含量。4-2、-20-2和-80-2在第6天首次從冰箱拿出，后續操作同上。4-3，-20-3和-80-3在第14天首次從冰箱拿出，后續操作同上。

1.2.3 細胞培養

小鼠乳腺癌細胞4T1培養在RPMI-1640培養液中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中，培養液中添加10%的胎牛血清，碳酸氫鈉1.5g/L，葡糖糖2.5g/L，丙酮酸鈉0.11g/L，1%的青鏈霉素。細胞鋪滿培養瓶約80%后，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.4 MTT法測定體外藥效的變化

細胞胰酶消化制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔細胞培養板，每孔100μL，24h待細胞貼壁后開始給藥，以蛋白含量設置藥物梯度，0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg/mL，每個濃度設置5孔，48h后測定570nm下的吸光度，計算經九香蟲血淋巴處理的4T1細胞活力，SPSS17.0計算半數致死濃度IC50值。

細胞活力=[（試驗組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）]×100%

1.2.5 數據分析

數據均采用均值±標準差表示。試驗數據用SPSS 17.0進行分析，不同組之間采用單因素方差分析比較差異性，P<0.05為具有顯著差異性。

2 結果與分析

2.1 九香蟲血淋巴的沉淀產生情況

九香蟲血淋巴放置在不同溫度條件下，均有沉淀產生，且每個存放時間點首次取出血淋巴產生的沉淀均無規律性，在2、6、14d時，4℃下首次取出沉淀質量分別為0.080、0.090、0.162g遞增趨勢，-20℃下首次取出沉淀質量分別為0.098、0.086、0.119g，先減少后增加，出現不穩定情況，-80℃下沉淀質量為0.070、0.046、0.028g，遞減趨勢;在同一天取出的血淋巴，2、6、14、21d產生的沉淀結果顯示，取出次數多的沉淀質量均少于取出次數少的，28d的沉淀質量結果不同于上述規律;另外4、-20、-80℃總的沉淀質量分別為0.494、0.479、0.325g，顯示在-80℃冰箱的九香蟲血淋巴沉淀最少，且取出次數越少，產生沉淀（0.083<0.099<0.143）越少（表1）。

2.2 九香蟲血淋巴總蛋白含量的變化

九香蟲血淋巴放置在不同溫度條件下，均出現總蛋白含量的變化。九香蟲血淋巴最初總蛋白含量為41.89±0.78mg/mL，在2、6、14d首次取出血淋巴總蛋白含量結果顯示，與0d總蛋白含量相比，-20-1（P=0.910）在第6d時無顯著性差異，4-2（P=0.169）和-20-2（P=0.081）在第14d時無顯著差異，-20-3（P=0.282）和-80-3（P=0.741）在14d首次取出的總蛋白含量無顯著差異，其他情況均有較大程度的下降，差異極顯著（P<0.001），-80℃下保存14d非首次取出的血淋巴總蛋白含量（P<0.001）大于初始總蛋白含量，差異極顯著（表2）。

2.3 九香蟲血淋巴體外抗癌活性的評價

最初提取的血淋巴，對其進行體外抗癌活性檢測（圖1），與對照組相比，不同蛋白濃度的九香蟲血淋巴均極顯著抑制細胞的增殖（P<0.001），并且呈劑量依賴性，計算得出IC50值是0.131mg/mL。

在第2天時首次取出4、-20、-80℃冰箱儲存的血淋巴，進行體外抗癌活性的評價（圖2）。結果顯示，與對照組相比，不同濃度的九香蟲血淋巴對小鼠乳腺癌細胞的增殖均有極顯著的抑制效果（P<0.001），與4℃保存的血淋巴作用于細胞的效果比較，在血淋巴濃度為0.05mg/mL時，-20℃的抑制效果有極顯著降低（P<0.001），-80℃的抑制效果有顯著降低（P<0.05），在血淋巴濃度為0.1mg/mL時，-20℃的抑制效果有極顯著降低（P<0.001）。在4、-20、-80℃溫度下保存的九香蟲血淋巴作用于體外乳腺癌細胞的IC50值分別為0.042、0.061、0.046mg/mL。

在第6天時首次取出4、-20、-80℃冰箱儲存的血淋巴，進行體外抗癌活性的評價（圖3）。結果顯示，與對照組相比，不同濃度的九香蟲血淋巴對小鼠乳腺癌細胞的增殖均有極顯著的抑制效果（P<0.001），與4℃保存的血淋巴作用于細胞的效果比較，在血淋巴濃度為0.05mg/mL時，-80℃的抑制效果有顯著降低（P<0.05），在血淋巴濃度為0.15mg/mL時，-80℃的抑制效果有極顯著降低（P<0.001）。在4、-20、-80℃溫度下保存的九香蟲血淋巴作用于體外乳腺癌細胞的IC50值分別為0.011、0.016、0.014mg/mL。

在第14天時首次取出4、-20、-80℃冰箱儲存的血淋巴，進行體外抗癌活性的評價（圖4）。結果顯示，與對照組相比，不同濃度的九香蟲血淋巴對小鼠乳腺癌細胞的增殖均有極顯著的抑制效果（P<0.001），與4℃保存的血淋巴作用于細胞的效果比較，在血淋巴濃度為0.1mg/mL時，-20℃的抑制效果有極顯著降低（P<0.01），在血淋巴濃度為0.15mg/mL時，-20℃的抑制效果有極顯著降低（P<0.001）。在4℃、-20℃和-80℃溫度下保存的九香蟲血淋巴作用于體外乳腺癌細胞的IC50值分別為0.021、0.022、0.017mg/mL。

上述抗癌活性結果中，在0.05、0.1、0.1mg/mL濃度下出現顯著性差異（P<0.05），因此，對不同溫度下的這三種濃度在不同時間對細胞的作用情況進行統計學分析，結果顯示僅在-80℃下0.15mg/mL濃度下，第6、14天無顯著性差異（P=0.423），其余情況下均有顯著性差異（P<0.05），且相比較4、-20℃溫度下，-80℃溫度下九香蟲血淋巴抗癌活性（第2、6、14天）相對變化較小（圖5）。

3 結論與討論

九香蟲作為廣泛應用的一味傳統中藥，具有良好的抗癌活性。本研究旨在探究九香蟲血淋巴的不溶性沉淀的產生對其總蛋白含量及抗癌活性的影響，以期找出九香蟲血淋巴的較適保存溫度。

小鼠乳腺癌細胞系4T1是一種高度惡性，高自發轉移的細胞系，接種Balb/c小鼠后，可自發形成具有高轉移腫瘤，自發轉移至肺等，在腫瘤發生、轉移上與人類乳腺癌相似[11-14]，是乳腺癌研究中常用的三陰性乳腺癌細胞系。

前期研究結果表明，九香蟲血淋巴的抗癌活性物質主要為蛋白質[8-10]，故本研究選擇血淋巴總蛋白含量作為判斷穩定性的指標之一，此外，本研究選擇了血淋巴產生的沉淀量作為另一個指標。本文研究表明，存放于不同溫度下的血淋巴均會產生不同質量的沉淀，相對而言，儲存于-80℃冰箱中的血淋巴所產生的沉淀較少，且取出次數越少，沉淀質量越小;總蛋白含量方面，在14d時首次取出保存在-20℃和-80℃下總蛋白含量與初始無顯著差異，綜上所述，九香蟲血淋巴的較優條件為保存在-80℃冰箱，并且盡量分裝，避免反復凍融。九香蟲血淋巴不同處理體外抗癌活性的評價顯示，不同濃度九香蟲血淋巴對乳腺癌細胞均有極顯著的抑制生長增殖的效果，并且與初始血淋巴的體外抗癌活性相比，保存于不同溫度下的九香蟲血淋巴，體外抗癌活性進一步提高，結果顯示總蛋白質含量的下降并不能降低血淋巴的體外抗癌活性，提示九香蟲血淋巴可能存在某一類抗癌活性蛋白不易降解，或者九香蟲血淋巴存在某一類抗癌活性物質的前體，后期進一步活化而使九香蟲血淋巴的抗癌活性進一步增強。在第6天時抗癌活性基本上達到最強，提示九香蟲血淋巴中沉淀產生，可能導致其中的抗癌活性物質濃度升高，從而抑制細胞的作用加強，后期的細胞抑制作用減弱，可能是抗癌活性物質的部分降解引起的。而在第6天時，-80℃下的血淋巴相對減弱了抑制細胞的作用，原因可能是相比4、-20℃產生的沉淀較少，抗癌活性物質的濃度相對低于4、20℃，這也從另一方面說明了保存在-80℃的血淋巴相對穩定。

綜上，本研究結果表明，九香蟲血淋巴穩定性較差，但并不影響其血淋巴體外的抗癌活性，保存于-80℃的九香蟲血淋巴的穩定性和抗癌活性穩定性較好，本研究結果可為九香蟲資源的進一步開發利用提供參考。

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