姜黃揮發油誘導肺癌細胞凋亡及機理研究

趙明明，盧彩會，牟德華，*

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050000）

姜黃揮發油（Curcuma longa L.volatile oil，TVO）為姜科植物姜黃（Curcuma longa L.）的塊狀根莖經水蒸氣蒸餾法得到的揮發性油，所含成分較為復雜，一般含有數十至數百種組分，其主要成分是芳姜黃酮（約為40%）、姜烯等化合物[1-4]。姜黃揮發油具有抑菌、抗炎鎮痛、抗氧化、抗腫瘤、抗淤血、抗血管生成及降血脂等功能[5-11]。近年來國內外研究表明，姜黃揮發油具有良好的抗腫瘤效果，可以有效抑制人皮膚癌SCL-1[12]、皮膚鱗狀細胞癌A431[13]、肝癌細胞MMC-7721[14]、急性單核細胞白血病THP-1 細胞[15]的增殖。

癌癥是全世界最致命的疾病之一，是人類死亡的第二大主因。中國肺癌發病率在過去40 年快速升高，其5 年生存率僅為20%，并已成為中國發病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一[16]。肺腫瘤分為兩種組織學類型：15 %為小細胞型肺癌（small cell lung cancer，SCLC），85%的肺癌病例為非小細胞型肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），是最常見的侵襲性類型細胞，到NSCLC 被診斷時，大多數情況下已經擴散到身體的其他器官，A549 細胞便是非小細胞肺癌細胞系的一種[17-18]。由于使用抗癌化學藥物殺死癌細胞的同時，會對正常體細胞產生一定的毒副作用。因此對于天然產物中高效、低毒的抗癌活性成分研究成為現代國內外的研究熱點[19]。最近，植物來源的生物活性化合物被認為是一種有效的抗癌劑，其中植物來源的精油已被用于醫藥應用[20]。

姜黃中的主要有效活性物質是姜黃素類化合物和姜黃油，目前國內外對其功能性的研究報道主要針對于姜黃素類化合物，由于姜黃揮發油的提取及溶解的復雜性故對于姜黃揮發油的功能性研究較少。因此，本文從細胞的活力、形態、遷移能力、凋亡周期等多方面系統地研究姜黃揮發油及主要成分抑制A549 細胞增殖作用及促進其細胞凋亡的機理。為不斷地深入研究姜黃揮發油的抗腫瘤作用機制提供試驗依據，同時也為后期尋找高效且低毒的天然抗癌藥物開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌A549 細胞：由河北科技大學生物科學與工程學院提供并傳代培養維持。

制備姜黃揮發油：采用產于印度卡納塔克邦的姜黃根莖，打碎過40 目篩，使用離子液體[BMIM]PF6 酶法輔助提取得到的姜黃揮發油為橙黃色透明狀液體，且具備典型的姜黃氣味[21]。

制備姜黃揮發油儲備液：將制備得到的姜黃揮發油用0.1 %二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，且稀釋成不同的濃度備用。

RPMI-1640 培養基、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素（雙抗）：Gibco 公司；胎牛血清：石家莊茂財生物科技有限公司；噻唑藍溴化四唑（methl thiazolyl tetrazolium，MTT）、5-氟尿嘧啶、芳姜黃酮（純度＞99.8%）、二甲基亞砜、吖啶橙：上海寶曼生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）：北京索來寶科技有限公司；膜聯蛋白-V/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡試劑盒：上海翊圣生物科技有限公司；多聚甲醛：天津市永大化學試劑有限公司；結晶紫：天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

分析天平（ar2140）：美國奧豪斯儀器有限公司；CO2培養箱（BPN-150CH）：上海一恒科學儀器有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-IFD）：蘇凈集團安泰空氣技術有限公司；離心機（LG10-2.4A 型）：北京醫用離心機廠；自動控壓蒸汽滅菌鍋（D-1-70 型）：北京發恩科貿有限公司；全波長酶標儀（EPOCH2 型）：美國博騰儀器有限公司；熒光倒置顯微鏡（IX51）：日本奧林巴斯公司；流式細胞儀（accuriC6）：美國 BD 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養

將人肺癌A549 細胞培養于由RPMI-1640 基本培養基：胎牛血清和雙抗以90 ∶10 ∶1 的質量比配置成的完全培養基中，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度環境的細胞培養箱中培養，細胞貼壁生長至80%～90%時即可消化傳代，取傳代至第2 代～4 代且生長狀態良好的細胞進行試驗。

1.3.2 細胞增殖檢測

取生長至對數期的A549 細胞，經胰蛋白酶消化離心后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基將其調整至 5×104個/mL 的細胞懸液，每孔 100 μL 接種于 96 孔培養板中。在 CO2培養箱中，37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養24 h。待細胞貼壁完全后，吸去培養基，藥品組加入經0.1%DMSO 稀釋成終濃度分別為25、50、100、200 mg/L 的姜黃揮發油培養液。陽性對照組為80 mg/L 的5-氟尿嘧啶和50 mg/L 的芳姜黃酮。另設細胞對照組（不加藥）和空白調零組（只加RPMI-1640 培養基），每組均設置6 個重復試驗，分別培養24、48、72 h，每孔加入 MTT 溶液（5g/L）20 μL，且調零組不加MTT，培養箱中繼續孵育4 h。小心吸去培養基，在每孔加入150 μL 0.1%DMSO，搖床低速振蕩20 min至徹底溶解。酶標儀測定在490 nm 波長處各孔的吸光度（optical density，OD）值，計算細胞增殖抑制率，計算公式為：

細胞增殖抑制率/%=（OD1-OD2）/（OD1-OD3）×100

式中：OD1為對照組的吸光度值；OD2為加藥組的吸光度值；OD3為空白調零組的吸光度值。

1.3.3 吖啶橙（acridine orange，AO）染色

取生長至對數期的A549 細胞，經胰蛋白酶消化并稀釋細胞密度為5×105個/mL 接種到6 孔板，置于細胞培養箱（37 ℃，5%CO2）中孵育，待細胞長到70%～80%左右時，更換培養基同時加入不同濃度姜黃揮發油（50、100、150 mg/L）1 mL/孔，并設置空白對照組和五氟尿嘧啶陽性對照組。加藥處理24 h 后加入40 μL 30 mg/L 的吖啶橙AO 染液避光染色10 min 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的形態變化并拍照記錄[22]。

1.3.4 細胞凋亡周期檢測

取生長至對數期的A549 細胞，經胰蛋白酶消化并稀釋到細胞密度為5×105個/mL 接種到6 孔板中，培養至貼壁24 h 后進行加藥處理，設置姜黃揮發油的濃度梯度為 50、100、150 mg/L。孵育 48 h 后，加入 0.25%的胰酶進行消化，收集每個孔內的細胞，且死細胞一并收集。用預冷的PBS 緩沖溶液沖洗兩次后，離心后棄上清液，加入100 μL 1×Binding Buffer 以重懸細胞，隨后加入 5 μL Annexin V-FITC 及 10 μL PI 工作液混勻，37 ℃避光孵育 15 min。再加入 400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放入冰上，樣品在1h 內用流式細胞儀上機檢測[23]。

1.3.5 細胞遷移檢測

1.3.5.1 細胞劃痕試驗

將細胞密度為5×105個/mL 的A549 細胞接種到6孔板，待單層長滿后，使用20 μL 無菌微量移液器尖端在各孔細胞中間垂直畫一個“一”字。無菌的PBS 洗去脫落的細胞，加入無血清的RPMI-1640 基本培養基，藥品組分別加入終濃度為50、100、150 mg/L 的姜黃揮發油，陽性對照組加入濃度為80 mg/L 的5-氟尿嘧啶，空白對照組用0.1%DMSO 處理。將6 孔板置于培養箱中，分別培養0、48、72 h 后每孔選取3 個不同視野進行顯微鏡拍照觀察。

傷口愈合率/%=（0 h 劃痕距離-48/72 h 劃痕距離）/0 h 劃痕距離×100

1.3.5.2 集落形成試驗

取生長至對數期的A549 細胞，經胰蛋白酶消化并調整細胞密度為1×103個/孔，接種到6 孔板中，培養24 h 后傾棄培養基。陽性對照組加入濃度為80 mg/L的5-氟尿嘧啶，試驗組分別加入濃度梯度為50、100、150 mg/L 的姜黃揮發油進行處理，0.1%DMSO 作為空白對照組。孵育48 h 后吸出原培養基，用pH 6.8 的磷酸緩沖溶液洗滌2 次，加入無任何藥物的新鮮培養基，根據培養液中pH 值的變化更換培養基。在第10 天時用4%多聚甲醛固定細胞，在溫度為25 ℃時用0.2%的結晶紫染色30 min。顯微鏡下記錄大于50 個細胞的克隆數，后按下式計算集落抑制率。

集落抑制率/%=（接種細胞數-集落數/接種細胞數）×100

1.4 統計方法

本文中所有試驗均設置3 組平行。試驗數據采用SPSS 17.0 軟件統計分析，組間數據的比較采用（Oneway ANOVA）單因素方差分析，以P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 姜黃揮發油對細胞增殖的影響

姜黃揮發油對A549 肺癌細胞的抑制作用見圖1。

圖1 姜黃揮發油對A549 肺癌細胞的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of Curcuma longa L.volatile oil on A549 lung cancer cells

由圖1 可以看出，姜黃揮發油對A549 肺癌細胞的抑制作用呈現出一定的劑量和時間依賴關系。同一藥物濃度下，作用時間越長，抑制作用越明顯。同一時間段內，隨著藥物濃度增大，細胞增殖抑制率增加。當加入姜黃揮發油濃度為200 mg/L，作用72 h 時，細胞增殖抑制率達到72.93%。芳姜黃酮在姜黃揮發油中占39.37%，是姜黃揮發油中發揮抗腫瘤活性的主要成分[24-25]。本試驗中50 mg/L 的姜黃揮發油與陽性對照組50 mg/L 的芳姜黃酮對于細胞增殖抑制效果沒有顯著差異，進一步證明了芳姜黃酮是姜黃揮發油中起主要抑制腫瘤增殖作用的有效成分。

2.2 吖啶橙染色

姜黃揮發油對A549 肺癌細胞凋亡形態的影響見圖2。

由圖2A 可知，隨著加入姜黃揮發油濃度的增大，細胞數量呈明顯的減少趨勢。空白組與加藥組相比具有完整的細胞形態，細胞核染色亮度均勻，且細胞核邊緣比較清晰。圖2B 顯示，姜黃揮發油促使癌細胞外形發生了新月形顆粒狀的變化，細胞膜出現發泡現象，細胞體變小、變圓甚至脫落。且細胞核內染色質部分皺縮，細胞核濃聚、偏位[26]。經150 mg/L 姜黃揮發油處理條件下的大部分癌細胞已經凋亡且結構被完全破壞。可見姜黃揮發油對人肺癌A549 細胞具有很好的凋亡誘導作用。

圖2 姜黃揮發油對A549 肺癌細胞的凋亡形態影響Fig.2 Effect of Curcuma longa L.volatile oil on apoptosis of A549 lung cancer cells

2.3 流式細胞儀測定細胞周期

姜黃揮發油對A549 肺癌細胞凋亡周期的影響見圖3。

圖3 姜黃揮發油對A549 肺癌細胞凋亡影響Fig.3 Effect of Curcuma longa L.volatile oil on apoptosis of A549 lung cancer cells

由流式細胞散點圖可以看出姜黃揮發油抑制細胞增殖的可能性因素是誘導細胞凋亡。細胞凋亡的主要特征是來自于細胞質膜的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外化以及細胞中膜完整性的喪失[27]。由圖3a 看出，癌細胞由姜黃揮發油處理48 h 后表現出了4 種不同類型的細胞群，活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞以及壞死的細胞[28]。隨著加藥濃度的增大，細胞的凋亡率也隨之增加。當濃度為50 mg/L 時活細胞數比例為94.7%，凋亡率為5.2%。當濃度增加至150 mg/L 時，活性細胞數下降至56.2%，但細胞凋亡率上升至43.8%。試驗結果很好的證明了姜黃揮發油對于促進癌細胞凋亡起到了一定促進的作用。

2.4 細胞遷移試驗

2.4.1 劃痕試驗

姜黃揮發油對A549 肺癌細胞劃痕傷口愈合率的影響見圖4。

圖4 姜黃揮發油對A549 肺癌細胞劃痕愈合的影響Fig.4 Effect of Curcuma longa L.volatile oilon scratch healing of A549 lung cancer cells

由圖4a 所示，加藥處理48 h 和72 h，各濃度姜黃揮發油均具有抑制細胞遷移作用，且時間越長抑制作用越明顯。空白組細胞在72 h 時劃痕距離完全閉合，而經150 mg/L 姜黃揮發油作用過的細胞，劃痕距離不僅沒有縮短，并且發生了細胞向兩邊遷移的現象，細胞間的間隙增大且明顯脫落。如圖4b 所示，細胞劃痕愈合率與加藥濃度呈劑量依賴性關系。與空白對照組相比，不同濃度姜黃揮發油處理均能顯著抑制細胞劃痕閉合率（P＜0.05），且加藥濃度越高，傷口愈合能力越低。

2.4.2 集落形成試驗

姜黃揮發油對A549 肺癌細胞集落形成的抑制作用見圖5。

圖5 姜黃揮發油對細胞集落形成的影響Fig.5 Effect of Curcuma longa L.volatile oil on Cell Colony Formation

如圖5a 所示，為肺癌細胞A549 細胞經姜黃揮發油處理48h 后的集落形成情況，隨給藥濃度的升高，細胞集落形成率依次降低。圖5b 直觀的顯示了姜黃揮發油對癌細胞抑制作用的定量分析，姜黃揮發油各濃度劑量組與對照組相比，對肺癌細胞集落形成均具有顯著抑制作用（P＜0.05）[29]。當濃度為 150 mg/L 時，細胞集落增長抑制率達到94.2%。集落形成的試驗結果分析表明，姜黃揮發油可以顯著抑制人肺癌A549 細胞的增殖。

3 結論與討論

細胞凋亡是機體為了維持機體內環境的穩態平衡，而由基因控制的細胞自主性的有序死亡，這與基因的激活、基因的表達以及基因調控等作用功能相關。細胞周期調控紊亂凋亡減少及突變細胞惡性增殖是癌癥發生的一個重要因素，故誘導腫瘤細胞的凋亡、抑制癌細胞的增殖，是很多藥物阻礙腫瘤細胞生長的作用機制之一，也是預防和治療癌癥的有效途徑[30-32]。

近期對姜黃揮發油在癌癥方面的研究逐漸增加，作為一種天然的植物精油，其在多種腫瘤的防治過程中起到重要的作用[33]。本研究將姜黃揮發油作用于人肺癌A549 細胞，發現其能顯著的發揮抗癌作用并呈現出明顯的時間和劑量依賴性關系。通過MTT 試驗考察了姜黃揮發油對A549 細胞的存活率的影響，并且證實了芳姜黃酮是姜黃揮發油中發揮抗腫瘤效果的主要成分。AO 染色試驗發現姜黃揮發油作用在A549細胞后，能夠破壞其細胞結構，發揮促進細胞凋亡作用。流式細胞儀對其誘導的細胞凋亡周期結果進行分析，可以看出經不同濃度的加藥處理后的A549 細胞，其早期和晚期凋亡的細胞數量均有所增加。細胞遷移試驗結果顯示姜黃揮發油對A549 細胞的體外遷移能力具有明顯的抑制作用。姜黃的分布較廣泛，廉價易得，且姜黃揮發油的毒副作用小，這為進一步探索抗腫瘤的新型候選藥物提供了可能性，為抗癌藥物的開發與研究提供了依據。