椰子組培研究四十年

穆治華　李志瑛　劉蕊　范海闊

摘 ?要：組織培養對于椰子快速繁殖以及全球椰子產業發展具有重要意義。本文就40年來國內外在椰子組培快繁技術，包括椰子組培技術的重要性，不同外植體如胚芽、花序、子房等在組織培養中的應用與優劣，不同培養基和培育環境對組培效果的影響等要素，進行了詳細的總結和討論。同時總結了椰子組培快繁技術的進展，分析了目前限制椰子組培快繁技術發展的因素，提出了應對策略與具體建議。本文對椰子快繁技術及椰子種質資源保存具有參考價值。

關鍵詞：椰子;組織培養;外植體;激素

中圖分類號：S667.4 ? ? ?文獻標識碼：A

The Development of Coconut （Cocos nucifera L.） Tissue Culture Technology in the Past 40 Years： a Review

MU Zhihua1，2， LI Zhiying1， LIU Rui1， FAN Haikuo1*

1. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Germplasm Repository of Coconut， Wenchang City， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wenchang， Hainan 571339， China; 2. The University of Queensland， Brisbane， 4343， Australia

Abstract： Coconut tissue culture is an important technology for the future of the coconut industry. This paper has reviewed many valuable studies in the recent four decades. The importance of coconut tissue culture， differences and advantages of varies of explants （plumule， inflorescence， ovary）， the influence of different medium compositions and environmental conditions were presented in detail. A brief summary of many protocols created worldwide and China has been made. Subsequently， the restrains of coconut tissue culture were identified and listed， and some suggestions were made to overcome the limits. This literature review could help the coconut tissue-culturists to further discover the potential of coconut tissue culture.

Keywords： coconut; tissue culture; explant; hormone

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.027

椰子（Cocos nucifera L.）屬棕櫚科椰子屬，是一種高經濟價值的多年生單子葉喬木[1]。作為一種熱帶油料作物和食品原料，椰子在93個國家和地區均有分布[2]。目前，椰子種植業面臨很多嚴重的威脅，如生物性和非生物性脅迫及市場不穩定等[3]。作為最難以在體外繁殖的植物之一，傳統營養繁殖手段，如扦插、壓條、嫁接等很難用于椰子的培育繁殖。但是，利用組織培養技術，通過多種外植體誘導能夠批量獲得椰子的再生苗。本文總結了近40年（1980—2020年）國內外椰子組培工作的研究現狀及存在問題。

1 ?椰子及其重要性

椰子是棕櫚科椰子屬中唯一的物種[4]。很多學者認為椰子源自于波利尼西亞或者印度群島[5]。作為一種經濟作物，椰子遍布世界熱帶地區，在全球超過90個國家均有分布[6]。生長在不同地域的椰子，具有多樣遺傳學特性[4]。椰子是滿足熱區人民食品和油料需求的重要生存資源[7]，也被稱為“生命之樹”“大自然的超級市場”或“天堂之樹”[8]，在全世界熱帶地區尤其是亞太國家民生保障和食品安全中具有重要作用[9]，每年有大量的椰果及相關加工產品進入世界商品市場[8]。據世界糧農組織（FAO）2016年統計，世界椰子總產量為5900萬t，其中91%產自東南亞地區[10]。2014年，僅印度尼西亞就生產椰子1800萬t[9]。在菲律賓，椰子產業的農業人口從業比例和農業用地為各行業內第一[11];在印度，有1200萬人從事椰子種植、加工或銷售產業[9];在馬來西亞，超過90%的椰子種植戶是風險抵御能力相對較弱的中小型農戶[12]。由此可見，椰子生產對各椰子生產國的社會穩定、人民生活和經濟發展都有著巨大的影響。

2 ?椰子組培——椰子產業潛在的“助推器”

目前，世界椰子產業面臨著嚴峻的挑戰。斯里蘭卡出口發展委員會在2018年預測，2020年之前，世界椰子市場規模的增長幅度可達27%[13]，相應椰果等加工原材料的需求也將大幅度增加。但椰子產量自2010年就處于平臺期，未出現明顯增長[14]，這表明椰子供需平衡的局面被打破。而產量高、品種優良的椰苗將是椰子產業可持續發展、椰農收入提升的關鍵[15]。目前每年生產的椰

苗只能達到市場需求的20%，種植戶需要更多的種苗用于更新老化和遭受病害的椰樹[16]。傳統椰苗培育方法使用種果繁殖，繁殖系數較低，異花授粉導致后代性狀分離而個體差異大，無法保持親本優良性狀;種果體積大，休眠期短，難以大批量遠距離運輸。而椰子莖干孤立，頂芽為營養芽，側芽分化為花序，一般無分枝，因此扦插、嫁接、高空壓條方法無法應用于椰子的無性繁殖[2]。椰子從種子到第1次結果往往需要5～6 a[17]，最長可達8 a[18]。因此，傳統椰子繁殖方式無法持續提供穩定高產優質的種苗，更無法為世界椰子產業的發展提供足夠的動力[19]。為了彌補此劣勢，組培快繁技術被應用于椰子繁殖并快速發展[17]。過去60年里，椰子組培研究集中于胚培養（embryo culture）、體細胞再生（somatic embryogenesis）、花藥培養（anther culture）以及種質的低溫保存（cryopreservation）和遺傳轉化（genetic transformation）[3]。成熟的椰子組培快繁技術可在較短時間內，以較低的成本培育大量性狀優良或抗性強的椰子品種，從而提升椰農的收入[3， 19]。

椰子組培的目標是獲得能夠發育成完整植株的體胚，而體胚發生途徑是一種適用于與母體無維管連接的非合子細胞（組織）的組培方法，通過培養可形成具有兩極性、類似合子胚的組織結構[4， 20]。體胚發生途徑如下（見圖1）：外植體啟動、愈傷組織誘導、胚性愈傷組織生成、體胚誘導及萌發[21]。與傳統種苗生產、胚培養等方式不同的是，利用組培技術，一個外植體理論上最多可產生98 000株椰子種苗[4]。早在20世紀70年代，科學家就認為椰子體胚發生途徑是一種可行的試管椰苗生產方式[18]。

3 ?椰子組培簡史

在科研人員的不斷探索中，椰子組培技術在40年內快速發展。20世紀70年代早期英國Wye College第1次嘗試椰子組培后，多種外植體被用于椰子組培中，具體分為體細胞組織和合子組織。其中，體細胞組織的外植體包括嫩葉、未成熟花序、根、頂端生長點等，合子組織包括未成熟/成熟合子胚和胚芽[22-23]。此外還有子房、花藥等其他外植體[24]。20世紀八九十年代，上述外植體開始被用于椰子組培[25]，其中以完整胚、胚芽、花序、子房為誘導材料的較為常見，但試驗重復性不佳[16， 26]。1998年之前，大多使用花序作為誘導愈傷組織的外植體[27-28]。Blake等[29]和Hornung[30]最早使用椰子胚芽，但在得到胚性愈傷組織后未見后續報道[31]。1998年，墨西哥科學家報道了以胚芽為外植體獲得體胚的具體操作方法，該項技術使得從整胚中提取的胚芽成為最適用于產生胚性愈傷組織和體胚的外植體[30]。科學家們意識到作為一種分生組織，胚芽比未成熟花序對于誘導條件更敏感、誘導效率更高[23， 30]。此后，研究者從操作方法、基礎培養基成分、植物生長調節劑如生長素、油菜素內酯[32]、赤霉素[25]等方面對該方法進行了改良。盡管椰子組培研究起步較早，但由于椰子的體細胞組織對于試管培養環境的敏感性較差，取得成果有限，使得椰子成為最難以通過實驗室方法生產的植物之一[16， 33-34]，目前尚未發展出能夠被普遍接受的組培技術[22]。因此，開發更高效率的椰子組培技術，尤其是探索通過體胚發生途徑生產大量優良品種椰子苗的技術是非常必要的[4]。椰子組織培養時間線見表1和圖2。

4 ?體細胞培養體系

4.1 ?以花序為外植體

目前認為，體細胞及其組織可產生保持親本性狀的后代。未成熟花序及其花序軸（rachilla tissues）是早期椰子組培的常用外植體[25]。早在1977年，Eeuwens等[35]就嘗試使用椰子花序穗軸和幼嫩花序，并首次使用了Y3培養基。花序穗軸和幼嫩花絮經過誘導后產生的“膠質體”（colloids）去分化后形成愈傷組織[65]，最終形成體胚并在適宜環境內萌發形成完整幼苗[27， 66]。早期，使用穗軸的誘導方法再生能力有限，效果相對較差，經過培養基組分及激素濃度的改良后

誘導效率提高[27]。Verdeil等[27]使用含有0.2%活性炭和（1.5～3.5）×10?4 mol/L 2，4-D的固體培養基[18]。Magnaval等[67]以MS培養基中的大量元素、Nitsch培養基中的微量元素、MW培養基中的維生素組成的改良基礎養基，添加2，4-D后誘導獲得愈傷組織。Vidhana等[68]嘗試了4種不同的培養基，在含有24 μmol/L 2，4-D和0.25%活性炭的培養基中獲得了愈傷組織。

Perera等[34]認為，可用于誘導愈傷組織的花序的最佳取樣時間難以判斷，且取樣過程可能會對樹的莖尖造成致死性損傷。此外，花序的愈傷組織誘導率通常低于30%，實驗可重復性差[30]。Vidhana等[68]的研究中約有30%的花序產生了高度胚性的愈傷組織，但誘導出的椰子組培苗莖尖

無頂端分生組織，部分組培苗雖長出花枝，但有發育不正常的小花[1]。國內學者在試驗過程中也發現了該現象[1]。因此椰子未成熟花序作為外植體存在諸多限制。

4.2 ?花藥、子房作為外植體

20世紀80年代至今，Kovoor[69]、Iyer等[70]、Thanh-Tuyen等[56]、Monfort[71]等科學家嘗試誘導花藥，但均未獲得完整植株。Thanh-Tuyen等[56]在Blaydes培養基中加入6%～9%蔗糖，15%椰子水，0.5%活性炭以及2 mg/L NAA，體胚形成率低于1%[72]。Monfort[71]利用花粉獲得了少量的體胚，體胚萌發形成根尖和葉原基，但未發育成完整植株。Perera等[73]將產生的愈傷組織依次轉接至含有66 μmol/L 2，4-D的Y3培養基，無激素Y3培養基和含有5 μmol/L BAP和0.35 μmol/L GA3的Y3培養基進行誘導，通過100顆花藥產生的125個愈傷組織或胚性愈傷組織，獲得了20株組培苗[49]。同時Perera等[73]也發現kinetin和2iP可以提高愈傷組織的發生率。

子房源于親本體細胞，具有獨特的優勢。Perera等[50]以椰子幼嫩雌花中未受精子房為外植體，在含有100 μmol/L 2，4-D和0.1%活性炭的培養基上獲得愈傷組織，誘導率為41%，愈傷組織在含有5 μmol/L ABA的培養基上連續繼代培養后產生體胚。Perera等[50]還發現體胚在含有5 μmol/L BAP的培養基中可正常萌發形成芽。進一步試驗表明，當子房外植體接種在CRI72培養基（含有100 μmol/L 2，4-D和0.1%活性炭）時，可以穩定地產生愈傷組織;9 μmol/L TDZ可提高愈傷組織誘導率;從愈傷組織轉變至體胚的過程需要GA3激活;含有5 μmol/L 6BA和2iP的培養基能夠增加體胚成苗率。產生的體胚可繼代于含有66 μmol/L 2，4-D的培養基，但使用Y3培養基成長的體胚不需要任何植物生長調節劑也可以正常生長發育[50]。目前已建立較為完整的椰子子房再生體系，多種植物激素如TDZ、ABA、2iP、GA3被用于誘導試驗中[50]，效果不一。Perera等[50]利用該體系誘導出83株完整植株。Bandupriya等[75]根據前人經驗，歸納出完整的椰子子房再生體系，試驗流程見表2。

經過數十載的努力，椰子花藥、子房作為一種可行的組培外植體，擁有了較為完整的誘導體系。但相比之下，以花藥和子房作為外植體，只能獲得少量組培苗，繁殖系數較低[35]，遠不能滿足商業需求[75-76]。

4.3 ?其他體細胞作為外植體

已有研究表明，種苗或成熟椰子樹上的幼葉均可誘導出胚性愈傷組織[36]。以5 a樹齡的椰子樹幼葉為外植體，最短可在6個月內生成胚性愈傷組織。但剝取幼葉會對樹體產生破壞，同時愈傷組織形成率非常低（低于20%）[36， 77]，現已不再使用。

5 ?胚和胚芽作為外植體

外植體中較為成功的有穗軸（未成熟花序）、花藥、未受精子房，但在產生愈傷組織和體胚方面，胚和胚芽優于其他幾種外植體[23， 30， 74]。根據Pérez-Nú?ez等[4]的計算，使用一個胚芽理論上可產生98 000個體胚，與直接使用體細胞進行培育相比，其效率高出約五萬倍。因此，椰子胚芽使得開發更高效的組培技術成為可能[23， 78]。使用胚芽進行椰子無性繁殖多選用具有優良表現型（抗病等）的親本[23]。近10年，學者將椰子無性繁殖的研究重點逐漸由難以操作的體細胞培養轉向簡單易行的合子細胞培養[3]。目前，愈傷組織誘導、體胚形成、體胚萌發和成苗等已成為研究熱點[25]。

合子胚的成熟度是影響愈傷組織誘導、體胚生成的重要因素。5～6月齡的胚愈傷組織誘導率低，但8月齡及以上的胚多已萌發，無法使用[40]。未成熟合子胚的胚性愈傷組織誘導率約為50%，遠高于成熟胚的3%[25]。

植物激素和植物生長調節劑等會顯著影響椰子組培的效率。Karunaratne等[40]使用開花后6～7個月的胚，在12～20 μmol/L 2，4-D誘導下可產生白色、完整的、可產生體胚的愈傷組織，繼續使用8 μmol/L 2，4-D誘導，一半的愈傷組織產生了球狀體胚，繼而在10 μmol/L kinetin和BAP的刺激下，22%的體胚萌芽。除此之外，滲透壓調節物（osmoticum）、ABA、GA3對于椰子胚的萌發和成熟也有一定作用[79-80]。使用與Karunaratne等[40]相同的方法誘導愈傷組織后，Fernando等[46]使用2.5～7.5 μmol/L ABA誘導，在3～7周后可得到體胚。該實驗認為含有ABA的培養基可誘導大量胚性愈傷組織、嫩芽以至完整植株，其質量甚至高于在低濃度2，4-D培養基中得到的植株。

在使用椰子胚芽作為外植體進行無性繁殖時，2，4-D可以快速誘導出愈傷組織。Hornung[30]使用400 μmol/L 2，4-D，約一年后得到成熟體胚。油菜素甾醇及抗細胞分裂素（anticytokinins）也可以使體胚誘導率增加1.5～2.5倍[32]。Rajesh等[16]在誘導初級愈傷組織時使用4.54 μmol/L TDZ，在繼代培養時使用100 μmol/L精氨（spermine）和1000 μmol/L腐胺（putrescine），結果顯示外源多胺類可以提高椰子體胚發生率。

早期，科學家多使用整胚（成熟或不成熟的）作為椰子組培的外植體。此后，嘗試胚不同部位的切片用作外植體[45， 81]。后期驗證，從胚的中心取得的切片最適于產生胚性愈傷組織，誘導率為58%，當使用遠離胚中軸的組織時，愈傷組織的誘導率會急劇下降[25]。隨著時間的推移，胚切片技術已不再用于愈傷組織的誘導，取而代之的是直接從胚中分離胚芽[47]。目前掌握該技術的研究機構主要有澳大利亞昆士蘭大學（The University of Queensland）和墨西哥尤卡坦科學研究中心（Unidad de Biotecnología， Centro de Investigación Científica de Yucatán， CICY）等。該技術可對次級體胚（secondary somatic embryos）進行數次重復分割并繼代以增加體胚的產量，尤其對組培低敏感型的植物（例如椰子）來說是快速增殖的方法之一[82]。幾十年內，以胚芽為外植體的椰子組培快繁技術快速發展，并被廣泛使用。但使用椰子胚芽作為外植體也有限制，例如異花傳粉導致胚芽可能為雜合子，從而誘導產生的組培苗表現型無法確定，可能出現與親本性狀不一致現象而產生后代異質性（heterogeneity）[74]。此外，該體系還存在組織褐化、反應不敏感、體胚誘導率低、個體特異導致的組織變異等問題[16， 26]。

6 ?中國椰子組培研究進展

相比世界椰子主產國，中國椰子組培快繁技術起步較晚。究其原因，椰子并非中國的主要經濟作物，全國只有海南省能夠規模化、商業化生產椰果，因此國內市場動力不足，研究投入較少，椰子產業的發展相對滯后，所以與世界椰子主產國相比，椰子相關的科學研究也較少。

國內椰子組培研究最早報道于1991年。陳幸華[83]以3%蔗糖和0.5%瓊脂的MS培養基為基礎培養基，加入NAA、KT、BA和2，4-D和不同劑量的活性炭研究椰子胚的離體培養，試驗結果表明，活性炭不僅能防止褐變，還可以提高成苗率。1997年，國內學者開始探索椰子幼嫩花序離體培養的器官發生途徑，誘導幼嫩花序產生愈傷組織，后期花序軸的根部長出嫩芽，繼續培養后形成了具有根、葉結構的完整植株[1]。在以離體胚為外植體進行培養的過程中，研究發現5%蔗糖濃度的培養基最適于進行椰子合子胚的離體培養[84]。2010年，中國熱帶農業科學院椰子研究所以椰子成熟胚和幼嫩花序為誘導材料研究了愈傷組織誘導及其褐變的控制，研究結果表明長度為16.5 cm佛焰苞（幼花序）誘導效果最好;含有25 mg/L 2，4-D、2.5 g/L活性炭和5 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的Y3培養基的誘導率最高且對材料褐變有抑制作用[85]。在愈傷組織誘導和體胚誘導中，通常以添加2，4-D、麥草畏、NAA等激素的Y3培養基為誘導培養基。2014年，國內學者使用布迪椰子（Butia capitata或凍子椰子）種子成熟胚和含有0.5 mg/L NAA，0.5 mg/L 2，4-D，0.5 mg/L BAP，60 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂的MS培養基，誘導出的愈傷組織效果最好[86]。

綜上所述，國內的椰子組培快繁研究起步較晚。從研究的主體來看，主要集中于培養基的研究，缺乏對于椰子組培快繁的全過程研究以及基于組培技術的轉基因技術研究;從外植體的角度來看，主要采用比較簡便易行的體細胞培養（如花序）或整胚作為外植體進行試驗，缺乏使用主流高產外植體如胚芽進行研究。國內的椰子無性繁殖研究與此領域內的領先國家，如墨西哥、澳大利亞、印度尼西亞、越南、印度、斯里蘭卡等國仍有明顯差距。

7 ?存在問題與展望

7.1 ?存在問題

40年來國內外對椰子組織培養進行了大量的研究，在理論、操作等方面取得了進步并初步建立了組培快繁體系，但尚未成熟，未被廣泛推廣和應用[2]。目前還有很多部分解決或未解決的問題，例如外植體對于組培的響應不同、試管苗生長緩慢、移栽田間的試管苗缺乏活力等[3]。Gichner等[87]認為組培技術無法推廣的原因主要有以下五點：技術不成熟、時間長且成本高;長期無法解決工程學、生物學對組培的限制;無性繁殖植株質量極低;復合人才缺乏。針對椰子組培來說，有以下技術難點：首先合子胚的培育效率較高但合子胚多為雜合子，無法在早期確定組培苗的性狀，需等待數年至結果才可觀測;其次親本基因型、人員技術、內源及外源污染、生長微環境變化、組織褐化、不成熟的煉苗技術均對椰子組培的結果產生巨大影響，損失率高;技術重復性較差，實驗結果差異大。不同批次的椰果、試劑、操作人員、操作環境等因素的差異都有可能導致試驗無法重復。同時其他棕櫚類組培結果顯示，組培苗移栽大田后可能會出現大量未知變異。憑借目前的技術，此類變數在組培階段無法預測。

在椰子組培技術的回報率與商業化推廣目前尚不明確的情況下，如何推廣現有成熟的椰子組培技術（如胚培養技術）是目前行業存在的主要問題之一。當下組培技術成本較高，對于發展中國家更是如此。椰子十大主產國為印度尼西亞、菲律賓、印度、巴西、斯里蘭卡、越南、巴布亞新幾內亞、墨西哥、泰國和馬來西亞，這些國家多為發展中國家，科研水平較低、科研投資較少，部分國家不具備獨立完成椰子組培工作的軟、硬件實力和經濟基礎。商業組培的成本主要包含組培實驗室建筑及內部布置費用、試劑耗材費用和基本的水電運行費用。國際原子能機構（IAEA）與世界糧農組織（FAO）對印度調研后發現，在印度設立一家低成本、中等規模（可生產儲存20萬株左右的組培苗）的組培工廠（195 m2），土地費用和改建費用可達6.25萬美元，設備租用費為5000美元/年[88]。因此組培技術只能用于具有高價值的植物種類[89]。一些發展中國家的學者采取試劑替代品希望能在硬件方面降低成本，如Bhattacharya等[90]采用2種印度常見植物西谷椰子（Metroxylon sagu Rottb.）和卵葉車前（Plantago ovata Forsk.）的提取物作為瓊脂的廉價替代物，同時使用濾紙、尼龍布、聚苯乙烯泡沫（polystyrene）和玻璃棉（glass wool cloth）作為支撐材料。Shivakumar等[91]提出使用殼聚糖（chitosan）作為一種低成本抗菌劑以減少內生菌的污染。但對于成本占比最高的人工成本（如技術員、勞工、檢測員、銷售市場人員）及人員招募、培訓費用目前仍無有效的解決辦法[92]。Gichner等[87]也認為在組培過程中轉移體胚、嫩芽、植株等植物組織的步驟對實操技術要求較高。不僅如此，目前組培技術商業化產生的高額運營成本[89]也導致該技術無法廣泛使用。

7.2 ?未來展望

包括生物反應器（bioreactor）在內的各種新型生物技術已經廣泛運用于植物的組培快繁技術，但是目前在椰子組培中還未見報道。Nguyen等[3]認為，未來的椰子組培研究方向應著重于改良培養基和建立懸浮培養體系（suspension culture system），以提升生產體胚的效率，同時在煉苗步驟中也應更多地關注間歇浸沒系統（temporary immersion system）與光能自養系統（photoau-to?trophic systems）。目前已出現一些專門針對植物組織培養的生物反應器，如筏式/噴霧式生物反應器，其中間歇浸沒系統使用較為廣泛[93]。與固體、半固體、液體培養相比，間歇式浸沒培養可提高繁殖系數，同時減少勞動力、提高試管苗質量、增加馴化成活率，但其勞動力成本僅為固體培養的一半[94]，總成本可降低20%[95]。將組培苗從試管環境中轉移至室外環境是勞動密集型的工作，使用大批量生產技術可減少12%的成本支出，使用改良的組培方法可以減少24%，而使用半自動設備的成本降低幅度可達35%[87]。Nguyen[3]認為，在未來可以嘗試使用含有多種有益成分的“液體胚乳”——椰子水作為液體培養基。同時，可通過研究體胚生成的相關基因來實現椰子組培技術效率的提升。通過了解椰子體胚發生基因的作用機理，可以篩選出更適于椰子組培的親本材料以減少組培工作對于椰子種果的需求。

國際合作在椰子組培以及相關領域的作用越來越重要。通過各國間的椰子種質資源互換和組培技術交流，椰子組培技術在全世界很多國家生根發芽。目前墨西哥尤卡坦科學研究中心（CICY）、澳大利亞昆士蘭大學（The University of Queensland）掌握了使用胚芽誘導愈傷組織生成植株的核心技術;法國農業國際合作研究發展中心（Centre de coopération internationale en recherche agronomique pour le développement， CIRAD）在胚培養技術以及生物反應器等方面處于領先;斯里蘭卡椰子研究所（Coconut Research Institute of Sri Lanka）則掌握了以子房和花藥為外植體的椰子組織培養的核心技術。通過與以上這些研究機構的學術交流，可以增強椰子組培技術的通用性。目前包括中國在內的39個椰子生產國加入了國際椰子遺傳資源網（International Coconut Genetic Resources Network， COGENT）致力于椰子產業的可持續發展以及椰子繁殖技術的推廣。包括椰子組培在內的國際技術合作已經引起了各國的重視，將來國際合作一定會為椰子組培事業帶來全新的動力。

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