重組人源膠原蛋白制備關鍵技術研究

重組人源膠原蛋白是基于人膠原蛋白的特征和主要功能序列重新優化設計的基因序列， 表達的蛋白質是設計序列翻譯的具有人膠原蛋白特征的蛋白質。 與傳統提取獲得的膠原蛋白相比，具有可加工性、無病毒隱患、水溶性好、批次穩定和排異反應低等優點。

近年來， 由于其特有的三重螺旋結構和功能特性， 國內外科研人員開始聚焦重組人源膠原蛋白的研究。 Myllyharju 等（2000）使用甲基酵母Pichia pastoris表達人膠原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。 Rutschmann 等（2014）在大腸桿菌中將人源Ⅲ型膠原蛋白和病毒來源的脯氨酸羥化酶一起共表達，獲得羥化的重組膠原蛋白，產量為90 mg /L。 周愛梅等（2015）采用巴氏畢赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6 進行高密度發酵，獲得細胞外分泌型重組人源膠原蛋白。 SDS-PAGE 電泳分析證明：RHSC 具有確定的相對分子質量， 分別約為56 000 的蛋白質單體與112 000 的二聚體。實驗中運用透析法、鹽析與柱層析結合法對工程菌的發酵上清液進行純化。 侯增淼等（2019）為了獲得可實現工業化生產的重組人源性膠原蛋白，根據人Ⅰ型膠原蛋白Gly-X-Y 序列， 優選親水性的Gly-X-Y 膠原肽段設計人源性膠原蛋白氨基酸序列及對應的核苷酸序列，利用酶切技術構建pPIC9K-COL 表達載體，電轉化畢赤酵母獲得人源性膠原蛋白畢赤酵母工程菌，并對其進行發酵罐發酵、純化及鑒定。結果顯示，獲得表達量達4.5 g/L、純度大于95%的人源性膠原蛋白。中國專利CN201910420372.2 提供一種重組人源膠原蛋白及其應用， 所述重組人源膠原蛋白從氨基端依次包含：氨基端親和純化標簽、人源Ⅰ型膠原蛋白α2 鏈成熟肽鏈以及羧基端親和純化標簽。 根據該發明實施例的所述重組人源膠原蛋白，通過在人源Ⅰ型膠原蛋白α2 鏈成熟肽鏈的兩端都設計有特異性親和純化標簽，該重組人源膠原蛋白易于分離純化和檢測， 且該重組人源膠原蛋白具有更高的相對分子質量和特殊的理化性質，易于發酵和表達，產量高、用途廣。 CN201811590514.1 公開了一種提高重組人源膠原蛋白生產水平且降低蛋白質降解速度的發酵工藝，其首先將畢赤酵母菌種液接種到滅菌的發酵培養基中發酵培養，在甲醇誘導培養階段向發酵培養基中加入0.1～10 g/L 的檸檬酸銨。 CN201710512319.6 涉及一種酵母重組膠原蛋白的生產方法， 包括重組畢赤酵母工程菌構建及無需甲醇誘導的組成型分泌表達重組膠原蛋白的方法，首先在基因水平上利用畢赤酵母慣用密碼子優化膠原基因序列并人工全基因合成，然后整合進酵母染色體中，構建成組成型分泌表達的重組畢赤酵母工程菌。 發酵過程操作簡便，產量高。 CN201810707153.8涉及重組人源型膠原蛋白的羥基化方法，通過將來源于孢囊菌RH1 的脯氨酸羥化酶與人源膠原基因共表達，從而實現膠原的羥基化。CN201810062017.8 公開了一種重組人源膠原蛋白的純化方法，先采用固液分離技術、過濾技術以及超濾技術對大批量的重組人源膠原蛋白進行粗純，然后用離子交換層析技術進行精純，所得目標蛋白質純度大于98%，收率大于70%。CN201810048908.8 公開了一種畢赤酵母表達重組人源膠原蛋白的甲醇流加發酵工藝。所述工藝將畢赤酵母菌種液接種到滅菌的發酵培養基中，培養至甲醇流加誘導階段，甲醇流加誘導的0～32 h 的前期階段，甲醇流加速度為（5.25±0.25） L/h，33～96 h 的中期階段，甲醇流加速度為（6.75±0.25） L/h，97 h 至發酵結束的后期階段，甲醇流加速度為（5.25±0.25） L/h。該發明將甲醇誘導階段時改成分階段恒速流加，可以保證畢赤酵母在不同代謝時期對碳源的需求。CN201410837503.4公開了一種膜過濾法提取重組類人膠原蛋白的方法，采用巴斯德畢赤酵母Pichia pastoriSMD1168 作為菌種，進行種子培養、種子罐培養和發酵罐培養，得到畢赤酵母菌發酵液；通過除雜、脫色、超濾和凍干的操作，從畢赤酵母菌發酵液中提取重組類人膠原蛋白。 CN201310033299.6 公開了一種由真核菌生產的人源化基因重組人膠原蛋白，全長474 個氨基酸，由兩段完全相同的人Ⅲ型膠原片段串聯而成，C 端連接6 個組氨酸殘基作為特異性親和純化標記。 基因重組人膠原蛋白性能優于動物膠原蛋白和原核工程菌重組膠原；帶有特異性親和純化標記，易于得到高純度產品。

雖然利用重組表達系統生產人源膠原蛋白取得了一些進展， 但是還有很多問題亟需解決， 如表達系統、外源蛋白質表達產量、分離純化技術等。相信隨著基因工程、蛋白質工程技術等分子生物學研究的快速發展，重組人源膠原蛋白在食品、化妝品和生物醫學等領域的應用也將得到進一步的提高。