土壤磺胺類抗生素固相萃取–高效液相色譜法的構建與優化①

劉瀟雅，徐源洲，賀南南，李輝信，胡 鋒，徐 莉

土壤磺胺類抗生素固相萃取–高效液相色譜法的構建與優化①

劉瀟雅，徐源洲，賀南南，李輝信，胡 鋒，徐 莉*

(南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095)

設計正交試驗對紅壤中磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMZ)的萃取方法進行優化，并結合高效液相色譜，構建了固相萃取-高效液相色譜聯合測定法(SPE-HPLC)，并將該方法應用于不同抗生素以及不同類型土壤中SMZ的提取測定。結果表明，在以乙腈–磷酸鹽緩沖液為提取液、提取液量為10 ml、超聲時間為15 min、9 ml甲醇淋洗固相萃取柱(HLB)的條件下，紅壤中SMZ的提取效果最優，0.25 mg/kg的SMZ回收率達到85.58%，能夠滿足環境樣品的分析要求。利用該法提取測定紅壤中不同抗生素包括3種磺胺類抗生素(磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶)和2種四環素類抗生素(土霉素、鹽酸四環素)，結果表明，當抗生素濃度為0.25 mg/kg時，磺胺類抗生素(SAs)的回收率范圍在67.31% ~ 85.58%，四環素類抗生素(TCs)的回收率范圍在20.81% ~ 59.33%。利用該法分別提取測定不同類型土壤中的SMZ回收率，得到潮土中SMZ的回收率最大，達到92.92%，其次為荒漠土、紅壤、紫色土，最低的回收率出現在黃棕壤，僅為53.62%。據相關性分析表明，回收率與土壤電導率(EC)、微生物碳氮比(C/N)呈極顯著負相關(<0.01)，與陽離子交換量(CEC)、有機質(SOM)呈顯著負相關(<0.05)

土壤；固相萃取；高效液相色譜；正交試驗；磺胺類；四環素類

早在20世紀60年代，抗生素開始被用作飼料添加劑，以提高飼料利用率和促進動物生長，在畜禽養殖和水產養殖業中都有大量使用[1]。近年來，抗生素的使用呈上升趨勢，并且濫用情況十分嚴重。作為飼料進入動物體內的抗生素大部分隨排泄物排出體外[2]，部分排泄物作為肥料施用于農田，從而造成在土壤中抗生素的不斷積累[3-4]，進而對人體健康和生態環境造成嚴重的威脅[5]。在被檢測出的抗生素種類中，四環素類檢測出的濃度最高，磺胺類尤其是磺胺甲惡唑在廢水中檢出頻率最大[6]。

磺胺類藥物(sulfonamides，SAs)是一種人工合成的抗菌藥物，因具有“準”持久性和潛在的生態風險而備受關注[7]。它也是應用時間最早、范圍最廣的一類抗生素[8]。我國是磺胺類藥物的主要生產國，并且產量在持續增長，在20世紀90年代中期，我國磺胺類藥物產量就己經突破1萬噸，2003年產量更是突破2萬噸。目前，土壤磺胺類污染的三大來源分別是醫藥行業、水產養殖和畜牧業[9]。

與此同時，我國也是四環素類抗生素(tetracy-clines，TCs)的生產、銷售和使用大國[10]。由于四環素類抗生素在畜禽和水產養殖場的大量使用，導致其產生的動物糞便和尿液中含有較高的四環素活性成分，進而危害生態環境[11]。

由于土壤介質結構復雜，且具有多介質、多組分的特點，抗生素的精確測定依舊是一個挑戰。尹春艷等[12]建立了固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜的分析方法，分析蔬菜大棚土壤中抗生素的含量，其加標回收率達40.0% ~ 80.0%。李彥文等[13]利用超聲提取-固相萃取-高效液相色譜紫外檢測法，提取土壤中3種TCs和6種SAs，得到TCs回收率達19.35% ~ 96.77%，SAs回收率達25.81% ~ 93.50%。郭欣妍等[14]利用超高效液相色譜/串聯質譜法同時分析糞便、土壤和水體中25種獸藥抗生素，加標回收率可達50.0% ~ 121.9%。

但受土壤類型、抗生素類型等因素的影響，同一方法對土壤中抗生素的提取效率并不一致[15]。Blackwell等[16]使用EDTA-McIlvaine緩沖液作為土壤抗生素提取劑，提取不同土壤類型中的磺胺氯達嗪(sulfachloropyridazine，SCP)，回收率均在68% ~ 85%的范圍內，而對于土霉素(oxytetracycline，OTC)，在含沙土壤中回收率為58% ~ 75%，在含黏土壤中回收率為27% ~ 51%。因此構建適宜于多種土壤、多種抗生素提取測定的方法十分必要。

除了提取方法外，抗生素的主要檢測方法有高效液相色譜法[17-18]、液相色譜質譜聯用法[19]等。其中高效液相色譜法相比于操作復雜、成本昂貴的液相色譜質譜聯用法，具有成本低、檢測迅速、可實現自動化或半自動化，同時靈敏度高等優點，在多個領域應用廣泛。

基于以上，本研究以磺胺甲惡唑(sulfametho-xazole, SMZ)為目標抗生素，設計正交試驗，調整不同提取液、提取液用量、超聲時間及淋洗體積，優化紅壤中SMZ的提取方法，并結合高效液相色譜測定，構建紅壤中SMZ的最適提取測定條件，并嘗試將該法應用于其他SAs和TCs類抗生素的提取測定，同時選擇5種不同類型土壤，包括紅壤、潮土、黃棕壤、紫色土及荒漠土，驗證提取測定方法對不同類型土壤中SMZ的提取測定效果。

1 材料與方法

1.1 儀器設備與試劑

高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國，安捷倫公司)；恒溫振蕩器(金壇市江南儀器廠)；超聲波清洗器(昆山禾超聲儀器有限公司)；真空泵、十二孔固相萃取裝置(東康科技有限公司)；pH計(德國，Sartorius公司)；HLB固相萃取柱(60 mg/3 ml，美國，Waters 公司)；電子天平(SHIMADZU公司)；旋轉蒸發儀(德國BUCHI公司)；超純水儀(南京易普易達發展有限公司制造)；離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；冷凍干燥機。

磺胺嘧啶(sulfadiazine，SDZ)、磺胺甲惡唑(sulfa-methoxazole，SMZ)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine，SMR)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine，SDMD)、鹽酸土霉素(oxytetracycline hydrochloride，OTC)、鹽酸四環素(tetracycline hydrochloride，TC)標準品均購自Sigma公司，純度均大于98%。甲醇、乙腈及甲酸為色譜純。磷酸、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA Na2)、檸檬酸、磷酸氫二鈉、甲酸、鹽酸等為分析純。實驗用水為超純水。

標準品母液配制：準確稱取以上抗生素標準品各0.010 0 g，先加入少量甲醇將抗生素溶解，再用超純水稀釋定容至100 ml容量瓶，配制成100 mg/L的標準品儲備液，并放置在4 oC避光保存。

乙腈-磷酸鹽緩沖液配制：準確吸取1.35 ml磷酸，加入31.2 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)溶于1 L超純水中，混合搖勻(pH = 3.0)，再與乙腈等體積混合。

EDTA-McIlvaine緩沖液配制：稱取12.9 g檸檬酸、27.5 g磷酸氫二鈉、37.2 g乙二胺四乙酸二鈉，溶于水中并定容到1 L，混合搖勻(pH = 4.0)

1.2 基質加標試驗

取10 g自然風干、研磨粉碎并過100目篩的土壤，并根據加標試驗的要求，向處理的土樣中加入0.01、0.25、2 mg/kg的4種SAs(SDZ、SMZ、SMR、SDMD)和2種TCs(OTC、TC)標樣(將土壤濕度調節為最大持水量的70%)，拌好抗生素的土樣過夜，且過夜時間大于15 h，以保證抗生素與土壤樣品達到吸附–解吸平衡，每個處理設置4個重復。

1.3 正交試驗設計

在抗生素提取過程中，提取液、提取液量、超聲時間、HLB柱淋洗體積會影響土壤中抗生素的提取效果[20-21]。因此，本試驗選擇以上4個因素，設置了4因素3水平L9(34)的正交試驗。因素各水平如表1，從中確定從紅壤中提取SMZ的最佳條件。

1.4 提取和凈化方法

準確稱取土樣1 g，并加入0.4 g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)和一定體積提取液，混合超聲振蕩提取后，3 500 r/min離心10 min，取上清液，該步驟反復提取3次，合并提取液，濃縮至5 ml，加超純水稀釋至約18 ml，以保證乙腈含量低于5%[22]。之后，混合上清液以1.0 ml/min的速率通過 HLB柱(使用前需先用6 ml甲醇、6 ml超純水活化)進行凈化富集，然后用6 ml超純水清洗HLB柱并在真空條件下干燥30 min，最后用甲醇洗脫柱子，并收集洗脫液。將收集到的洗脫液旋轉蒸發至近干，用1 ml甲醇復溶，并過0.45 μm有機濾膜，收集到棕色瓶中，–20℃冷藏待測。

1.5 不同土壤SMZ加標回收率試驗

選擇5種不同土壤樣品，包括紅壤、潮土、黃棕壤、紫色土及荒漠土，自然風干、研磨粉碎并過100目篩，后按照1.2基質加標方法制得濃度為0.25 mg/kg的SMZ實際土壤加標樣品，進行不同土壤類型加標回收率試驗，每個處理設置4個重復。土壤基本理化性質見表2。

表1 正交試驗因素和水平

表 2 土壤的基本理化性質

1.6 樣品測定

1.6.1 標準曲線的繪制 將標準品母液用高純水稀釋成0.02、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/L的混合標準工作液。HPLC待測，以質量濃度()為橫坐標，峰面積()為縱坐標做標準曲線方程，同時得到其線性方程的相關系數(2)。

1.6.2 高效液相色譜測定條件 色譜柱：Shim- packVp-ODS(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；紫外檢測器，波長270 nm；流動相：乙腈︰0.1% 甲酸(80:20)；流量1.0 ml/min；進樣量20 μl；柱溫25 ℃。

1.6.3 準確度測定 回收率通常用來表示分析結果的準確性，指測定值與真實值之間的接近程度，實測添加量與標準添加量之比。

1.6.4 方法精密度測定 精密度是指按照某一方法重復測定同一均質樣品所得測定值之間的接近程度，表示分析結果的重復性，通常用相對標準偏差(relative standard deviations，RSD)表示，偏差越小說明精密度越高，而當精密度越高，則表明偶然誤差越小。試驗選取0.25 mg/L與2 mg/L的混合標準溶液分別進行連續6次進樣，考察各組分的遷移時間和校正峰面積的重復性。

1.7 數據統計方法

本試驗所有數據處理均采用Microsoft Office Excel 2010及SPSS 18.0，圖形繪制均采用Origin 9.0。其中，正交試驗方差分析采用單因素ANOVA分析，相關性采用Pearson分析。

2 結果與討論

2.1 正交試驗優化SMZ提取條件

土壤組分復雜，提取液的選擇以及提取液用量、超聲時間及HLB柱淋洗體積均會影響抗生素提取效率。為提高抗生素提取效果，尋求提取SMZ的最優組合，依據表1正交試驗因素和水平表，設計4因素3水平L9(34)的正交試驗處理為：A1B1C1D1、A1B2C2D2、A1B3C3D3、A2B1C2D3、A2B2C3D1、A2B3C1D2、A3B1C3D2、A3B2C1D3、A3B3C2D1，共 9組，結果表明9種處理下土壤SMZ平均回收率在18.16% ~ 85.58%，在以乙腈-磷酸鹽緩沖液為提取液、提取液量為10 ml、超聲時間為15 min、9 ml甲醇淋洗固相萃取柱(HLB)的條件下，紅壤中SMZ的提取效果最優，0.25 mg/kg的SMZ回收率達到85.58%，能夠滿足環境樣品的分析要求(表3)。

表3 正交試驗中9種處理的平均回收率

本研究的最佳提取液為乙腈-磷酸鹽緩沖液，加入乙腈的提取液提取效率得到改善，這是因為相比其他溶劑，乙腈的極性較強，同時磷酸溶液作為離子抑制劑可以有效消除色譜峰圖拖尾的現象，從而進一步提高測定效率。這與王娜[8]、郭欣妍等[14]的結果一致，但本研究中SMZ回收率，與之相比要高，這與本研究優化的提取液體積、超聲時間和固相萃取柱淋洗體積等條件有關[23-27]。提取液量過少會造成抗生素提取不完全，而過多又會造成雜質含量提高，檢測效果不佳。超聲萃取可加快抗生素快速脫離土壤樣品，但超聲過短，目標抗生素未完全脫離，會造成分離不徹底；而時間過長，則會損壞目標抗生素，并且浪費時間。本研究最佳超聲時間是15 min，與李云輝等[28]研究結果一致。

通過正交試驗測定結果直觀分析(表4)。可知各因素對SMZ回收率的影響主次因素依次為：提取液>HLB柱淋洗體積>提取液量>超聲時間。

表4 正交試驗結果直觀分析表

注：表示因素的試驗指標和，表示各因素的極差。

采用SPSS18.0軟件對正交試驗進行方差分析，結果如表5所示，可知提取液(>3.55)和HLB柱淋洗體積(>3.55)對試驗結果有顯著影響，這與直觀分析中的結果相一致。而相比于提取液與HLB柱淋洗體積，提取液量與超聲時間對結果存在一定影響，但均未達到顯著性。因此，正交試驗可以通過直觀分析方法分析不同因子的貢獻率，同時可以運用方差分析法對此進行驗證。

表5 正交試驗方差分析

注：*表示該因素對試驗影響顯著(<0.05)。從分布表中查出臨界值α(fj, fE)，比較值與臨界值的大小，若是F>α(fj, fE)，因素對試驗結果有顯著影響；若是F<α(fj,fE)，因素對試驗結果無顯著影響。

2.2 方法線性關系、檢測限及精密度

將標準品母液用高純水稀釋成0.02、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/L的混合標準工作液，在HPLC檢測條件下，對目標抗生素OTC、TC、SDZ、SMZ、SMR及SDMD進行檢測，發現能夠在22 min內實現快速分離TCs和SAs，其中各目標抗生素的色譜峰如圖1，發現各目標抗生素的峰形對稱，分離效果良好。

(從左至右目標抗生素依次為：鹽酸四環素(TC)、土霉素(OTC)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲基嘧啶(SDMD)、磺胺嘧啶(SDZ))

與此同時，分析得出6種抗生素濃度()與峰面積()的線性關系，其決定系數2均大于0.99，并且在3倍信噪比(S/N = 3)下計算2種TCs及4種SAs的方法檢測限，得到OTC為10.83 μg/kg，TC為16.02 μg/kg，SDZ為7.69 μg/kg，SMZ為4.86 μg/kg，SMR為6.32 μg/kg，SDMD為5.74 μg/kg(表6)。同時在10倍信噪比(S/N =10)下所對應的濃度計算定量限，得到OTC為16.77 μg/kg，TC為21.46 μg/kg，SDZ為13.98 μg/kg，SMZ為9.13 μg/kg，SMR為12.58 μg/kg，SDMD為11.27 μg/kg。同時選取0.25 mg/L與2 mg/L的混合標準溶液分別進行連續6次進樣，考察各組分的遷移時間和校正峰面積的重復性，得到2種TCs及4種SAs的保留時間的相對標準偏差(RSD)均低于0.31%，峰面積的RSD均低于1.44%(表6)，分離效果、重現性較好。

2.3 不同目標抗生素的加標回收率(%)及精密度

取空白土樣，分別制得濃度為0.02、0.25、2 mg/kg的4種SAs(SDZ、SMZ、SMR、SDMD)和2種TCs(OTC、TC)標樣，按1.4方法處理后，進行HPLC測定，并記錄各化合物的色譜峰面積，計算各待測化合物在空白土樣的方法回收率(表7)。同時，為保證測定過程的穩定性，每隔25個樣品進行1次標準工作液的校正。

表6 不同目標抗生素的線性方程、決定系數、方法檢測限及精密度

表7 目標抗生素的加標回收率(%)及相對標準偏差(n = 3)

綜合以上結果表明，利用上述優化的提取和凈化方法(即提取SMZ最佳組合A2B1C2D3)，當加標水平為0.25 mg/kg時各目標化合物的加標回收率最適合。SDZ的加標回收率為67.31%，相對標準偏差(RSD)為7.73%；SMZ的加標回收率為85.58%，RSD為1.76%；SMR的加標回收率為70.94%，RSD為1.87%；SDMD的加標回收率為68.31%，RSD為2.85%；OTC的加標回收率為59.33%，RSD為1.12%；TC的加標回收率為20.81%，RSD為4.57%。其中，該方法對4種磺胺類抗生素的添加回收率均高于65%，具有較高的準確性，RSD均小于10，具有較高的精密度，說明該方法較適用于環境樣品中磺胺類抗生素的檢測。

土壤對抗生素的吸附緊密程度會影響對抗生素的提取效率。抗生素本身的化學性質是重要因素之一。土壤與抗生素的吸附與抗生素在土壤–水界面之間的平衡系數Kd值有關，TCs具有較高的Kd值，與土壤表現出較好的親和力，易通過陽離子鍵橋、表面配位螯合體以及氫鍵等作用機制吸附在土壤中，表現出較強的土壤滯留性，不易從土壤中吸附出來[29-31]。而SAs的Kd值較低，在土壤中的吸附能力較弱，易從土壤中吸附出來[29-31]。因此TCs能較長時間穩定地殘留在土壤基質中，并且降低了其提取回收率。

此外，土壤理化性質也會影響抗生素的回收率，如楊曉蕾[32]研究表明TCs在酸性、黏粒含量較高的土壤中吸附性強。而本文中對抗生素加標回收率的研究，采用的是紅壤，紅壤為黏壤土、pH偏酸(pH = 4.83)，因此TCs也表現出較低的回收率。

2.4 不同土壤中抗生素加標回收率

2.4.1 不同土壤加標回收率 如圖2所示，將SMZ施入于不同土壤后，潮土的回收率最大，達到92.92%，分別高于紅壤、黃棕壤、紫色土及荒漠土7.33%、39.30%、32.89%、6.62%，且黃棕壤的回收率最低，為53.62%。

潮土與荒漠土中SMZ回收率最高，這與土壤pH較高有關，王娜[8]發現，pH>6.5使得SMZ陰離子比例大大增加，吸附性減弱，提高回收率。而這兩種土壤pH均大于6.5，因此SMZ回收率較高。而紫色土的pH同樣大于6.5，但其回收率卻依然較低，這可能與土壤其他性質有關，如顆粒組成等[33-34]。

紅壤中SMZ加標回收率居中，這可能是紅壤與其他土壤相比黏粒含量較高，并且有機質含量較低的原因。許靜等[35]研究發現江西紅壤黏粒含量較高，SAs在其土壤中的吸附性增強，易與土壤結合，不利于轉化，同時因紅壤中有機質含量較低，影響了土壤微生物活性，從而增加了SMZ的穩定性。

(圖中小寫字母不同表示不同土壤間SMZ加標回收率差異顯著(P<0.05))

黃棕壤提取效率最低，這與其較低的pH有關，SMZ在pH 4 ~ 6.5范圍內的主要存在形式為中性分子，而這些中性分子形態的有機分子容易與土壤有機質發生吸附，同時黃棕壤的有機質含量最高，這也有利于提高土壤微生物種群的數量和生物活性，增強對SMZ的降解作用，進而進一步影響了黃棕壤中SMZ的穩定性與提取效率，致使黃棕壤中SMZ的回收率低。

2.4.2 土壤性質與抗生素回收率的關系 為了進一步證明土壤性質與抗生素回收率的關系，進行了相關性分析。表8為SMZ加標回收率與5種土壤的pH、陽離子交換量(CEC)、有機質(SOM)、電導率(EC)及微生物碳氮比(C/N)的相關系數。可以看出，土壤EC、C/N與回收率呈極顯著負相關，其中，EC：2=–0.660、<0.01，C/N：2=–0.746、<0.01。CEC、SOM與回收率呈顯著負相關，其中，CEC：2=–0.547、<0.05，SOM：2= –0.544、<0.05。SOM與回收率呈負相關性，與前面的討論相一致，而CEC又是土壤重要的理化性質，會受土壤有機質影響，有機質含量高的土壤，CEC較高，也會為抗生素提供更多的結合位點，促進對抗生素的吸附，從而減少回收率。同時，CEC也會決定EC大小，因為電導率的產生和離子交換相關，從而EC也表現出與回收率的負相關。

表8 不同土壤性質與SMZ加標回收率相關性(Pearson 分析法)

注： **表示相關性達到<0.01 顯著水平(雙側)；*表示相關性達到<0.05 顯著水平(雙側)。

此外，土壤不同性質之間存在相關性，土壤SOM是影響CEC的重要因素，土壤CEC能夠反映土壤的保肥供肥能力，SOM與CEC呈正相關性；SOM、CEC又分別與微生物生物量C、N呈極顯著正相關[36-37]。

土壤理化性質會直接影響抗生素在土壤中的穩定性。如SOM增加，可以促進對抗生素的吸附，同時提高土壤微生物種群的數量和生物活性，降低抗生素的穩定性，進而降低抗生素的回收率。

3 結論

本試驗建立了固相萃取-高效液相色譜分析方法檢測土壤中4種SAs和2種TCs，結果顯示，整個分析檢測方法的檢測限為2.38 ~ 12.57 μg/kg。該方法對SAs有較好的提取分離檢測效果，靈敏度高以及穩定性也較好。土壤中SAs的加標回收率是67.31% ~ 85.58%，且相對標準偏差均低于8%，表明其準確度和精密度能夠滿足環境樣品的分析要求。比較了不同土壤中SMZ回收率，其中，潮土中SMZ的回收率最大，達到92.92%，其次為荒漠土、紅壤、紫色土及黃棕壤，且黃棕壤的回收率最低，為53.62%。SMZ回收率與土壤EC、C/N呈極顯著負相關(<0.01)，與CEC、SOM呈顯著負相關(<0.05)。

[1] Deng W, Li N, Zheng H, et al. Occurrence and risk assessment of antibiotics in river water in Hong Kong[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2016, 125: 121–127

[2] 孫剛, 袁守軍, 計峰, 等. 畜禽糞便中抗生素殘留危害及其研究進展[J]. 環境與健康雜志, 2009, 26(3): 277–279

[3] Liu J, Wang L, Zheng L, et al. Analysis of bacteria degradation products of methyl parathion by liquid chro-matography/electrospray time-of-flight mass spectrometry and gas chromatography/mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1137: 180-187

[4] Du D, Ye X P, Zhang J D, et al. Cathodic electrochemic analysis of methyl parathion at bismuth-film-modified glassy carbon electrode[J]. Electrochim Acta, 2008, 53: 4478–4484

[5] Van den Meersche T, Van Pamel E, Van Poucke C, et al. Development, validation and application of an ultra high performance liquid chromatographic-tandem mass spectro-metric method for the simultaneous detection and quantification of five different classes of veterinary antibiotics in swine manure[J]. Journal of Chromatography A, 2016, 1429: 248–257

[6] 張博華. 固相萃取-高效液相色譜聯用同時分析環境水體中四種喹諾酮類抗生素[D]. 泰安: 山東農業大學, 2016

[7] 李軍, 葛林科, 張蓬, 等. 磺胺類抗生素在水環境中的光化學行為[J]. 環境化學, 2016, 35(4): 666–679

[8] 王娜. 環境中磺胺類抗生素及其抗性基因的污染特征及風險研究[D]. 南京: 南京大學, 2014

[9] 朱偉曉. 水中磺胺類藥物的吸附去除機制與工藝研究[D]. 北京: 北京林業大學, 2016

[10] 楊曉芳, 楊濤, 王瑩, 等. 四環素類抗生素污染現狀及其環境行為研究進展[J]. 環境工程, 2014(2): 123–127

[11] 黃圣琳, 何勢, 魏欣, 等. 污水處理廠中四環素類抗生素殘留及其抗性基因污染特征研究進展[J]. 化工進展, 2015(6): 1779–1785

[12] 尹春艷, 駱永明, 滕應, 等. 典型設施菜地土壤抗生素污染特征與積累規律研究[J]. 環境科學, 2012, 33(8): 2810–2816

[13] 李彥文, 莫測輝, 趙娜, 等. 菜地土壤中磺胺類和四環素類抗生素污染特征研究[J]. 環境科學, 2009, 30(6): 1762–1766

[14] 郭欣妍, 王娜, 郝利君, 等. 超高效液相色譜/串聯質譜法同時測定水、土壤及糞便中25種抗生素[J]. 分析化學, 2015(1): 13–20

[15] Spielmeyer A, Hoeper H, Hamscher G. Long-term monitoring of sulfonamide leaching from manure amended soil into groundwater[J]. Journal of Chemosphere, 2017, 177: 232–238

[16] Blackwell P A, Lützh?ft H C H, Ma H P, et al. Ultrasonic extraction of veterinary antibiotics from soils and pig slurry with SPE clean-up and LC–UV and fluorescence detection[J]. Talanta, 2004, 64: 1058–1064

[17] 楊曉蕾, 李杰, 李學文, 等. 土壤中10種獸用抗生素的固相萃取–高效液相色譜–紫外測定法[J]. 環境與健康雜志, 2012, 29(4): 357–360

[18] 李彥文, 莫測輝, 趙娜, 等. 高效液相色譜法測定水和土壤中的磺胺類抗生素[J]. 分析化學, 2008, 36(7): 954– 958

[19] 馬麗麗. 固相萃取–高效液相色譜–串聯質譜法同時測定土壤中氟喹諾酮、四環素和磺胺類抗生素[J]. 分析化學, 2010, 38(1): 21–26

[20] 邰義萍, 莫測輝, 李彥文, 等. 固相萃取–高效液相色譜–熒光檢測土壤中喹諾酮類抗生素[J]. 分析化學, 2009, 37(12): 1733–1737

[21] 李曉晶. 土壤中β-內酰胺類抗生素的全自動固相萃取-超高效液相色譜–串聯質譜測定法[J]. 環境與健康雜志, 2016, 33(5): 456–458

[22] 孫奉翠. 土壤中四類典型抗生素的同時測定及其方法優化[D]. 濟南: 山東大學, 2013

[23] 國彬, 姚麗賢, 何兆桓, 等. 土壤中磺胺類抗生素的檢測方法優化及殘留、降解研究[J]. 土壤通報, 2012, 43(2): 386–390

[24] 孫剛, 袁守軍, 彭書傳, 等. 固相萃取–高效液相色譜法測定畜禽糞便中的土霉素、金霉素和四環素[J]. 環境化學, 2010, 29(4): 739–743

[25] 成玉婷. 廣州市典型有機蔬菜基地土壤中磺胺類抗生素污染特征及風險評價[J]. 中國環境科學, 2017, 37(3): 1154–1161

[26] 吳小蓮. 珠三角區域蔬菜中喹諾酮類抗生素污染特征與健康風險[D]. 廣州: 暨南大學, 2011

[27] 包艷萍. 珠三角蔬菜中磺胺類抗生素污染特征研究[D]. 廣州: 暨南大學, 2010

[28] 李云輝, 吳小蓮, 莫測輝, 等. 畜禽糞便中喹諾酮類抗生素的高效液相色譜–熒光分析方法[J]. 江西農業學報, 2011, 23(8): 147–150

[29] Tolls J. Sorption of veterinary pharmaceuticals in soil: A review[J]. Environ. Sci. Techno., 2001, 35: 3397–3406

[30] Golet E M J, Strehler A, Alder A C. Determination of fluoroquinolone antibacterial agents in sewage sludge and sludge-treated soil using accelerated solvent extraction followed by solid -phase extraction[J]. Anal. Chem., 2002, 74: 5455–5462

[31] Ji L, Wan Y, Zheng S, et al. Adsorption of tetracycline and sulfamethoxazole on crop residue-derived ashes: Implication for the relative importance of black carbon to soil sorption[J]. Environ. Sci. Technol., 2011, 45: 5580– 5586

[32] 楊曉蕾. 土壤中典型抗生素的同時測定及其方法優化[D]. 濟南: 山東大學, 2012

[33] Ho Y B, Zakaria M P, Latif P A, et al. Simultaneous determination of veterinary antibiotics and hormone in broiler manure, soil and manure compost by liquid chromatography–tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1262: 160–168

[34] 張勁強, 董元華. 諾氟沙星在4種土壤中的吸附-解吸特征[J]. 環境科學, 2007, 28(9): 2134–2140

[35] 許靜, 王娜, 孔德洋, 等. 有機肥源磺胺類抗生素在土壤中的降解規律及影響因素分析[J]. 環境科學學報, 2015, 35(2): 550–556

[36] 黎寧, 李華興, 朱鳳嬌, 等. 菜園土壤微生物生態特征與土壤理化性質的關系[J]. 應用生態學報, 2006,17(2): 285–290

[37] 張水清, 黃紹敏, 郭斗斗. 河南三種土壤陽離子交換量相關性及預測模型研究[J]. 土壤通報, 2011, 42(3): 627–631

Optimization and Detecting Sulfamethoxazole in Soils Using Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

LIU Xiaoya, XU Yuanzhou, HE Nannan, LI Huixin, HU Feng, XU Li*

(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this paper,an orthogonal experiment was designed tooptimize the extraction method ofsulfamethoxazole (SMZ) in red soil and a solid phase extraction-high performance liquid chromatography (SPE-HPLC) method was built for SMZ detection. The method was used to determine different antibiotics including SMZ from different soils. The results showed that the optimal extraction conditions for SMZ in the red soil was 10 ml acetonitrile-phosphate buffer as the extracting solution, ultrasonic oscillation time for 15 min and 9 ml methyl alcohol elution. The recovery of 0.25 mg/kg SMZ was 85.58%, indicating this method applicable for the environmental sample analysis. Meanwhile, this method was used to extract other antibiotics, including three sulfa antibiotics (sulfadiazine, sulfamerazine, sulfadimidin) and two tetracycline antibiotics (oxytetracycline, tetracycline), the average recoveries of 0.25 mg/kg sulfas and tetracyclines were 67.31%–85.58% and 20.81%–59.33%. Under HPLC with UV detection, the detection limit of SMZ was 2.38 μg/kg, showed a good accuracy. Simultaneously, the detection limits of sulfa and tetracycline antibiotics were between 2.38~12.57 μg/kg, indicating this method better suited to detect sulfa antibiotics in soil according to the laboratory quality control standard. Besides, the method was also used to test SMZ recoveries from different soil types, the largest SMZ recovery rate (92.92%) was obtained in fluvo-aquic soil, followed by desert soil, red soil and purple soil, while the lowest recovery rate (53.62%) were in yellow-brown soil. The correlation analysis showed that a significant negative correlation between recovery rate and soil EC, C/N (<0.01), and CEC, SOM (<0.05).

Soil; Solid-phase extraction; High performance liquid chromatograph; Orthogonal experiment; Sulfonamide; Tetracycline

中央高校基本科研業務費專項資金(KYZ201626)，公益性行業(農業)科研專項經費項目(201503121)和中國博士后科學基金面上項目(2016M591856)資助。

xuli602@njau.edu.cn)

劉瀟雅(1992—)，女，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事抗生素污染土壤的化學–微生物聯合修復研究。E-mail: 18260068658@163.com

X830.2

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.06.012