實驗室檢測技術在肺結核活動性判斷中的應用進展

付亮 鄧國防

我國肺結核疫情依舊嚴峻，是全球第二大結核病高負擔國家，2018年新發肺結核患者82.3萬例[1-2]。眾所周知，結核分枝桿菌病原學檢測陽性是診斷肺結核的金標準[3]，但目前我國仍存在大量病原學陰性(包括抗酸染色涂片、核酸檢測、培養等方法)肺結核患者，因缺乏有效的生物學標志物，使得實驗室檢測技術難以對此類患者的活動性判斷發揮有效作用，需要啟動規范的活動性判斷流程，即按照《肺結核活動性判斷及臨床應用專家共識》(以下簡稱“《共識》”)[4]對肺結核活動性判斷的評價方法，包括應用癥狀評價、治療史評價、實驗室評價、影像學評價和病理學評價工具，以指導臨床進行綜合評價。但由于實驗室檢測技術具有方便快捷、體外檢測、無機體損傷等優勢，進一步評估及開發其在肺結核活動性判斷上的意義仍然非常重要，并且將具有廣泛的應用前景。基于此，筆者對國內外相關研究進行論述。

一、結核分枝桿菌病原學檢測

目前，結核分枝桿菌病原學檢測仍然是肺結核活動性判斷最重要的評價指標。其中直接厚涂片、傳統的分離培養和分子生物學檢測是常用的痰結核分枝桿菌檢測技術，而分子生物學技術因可明顯提高活動性肺結核痰液病原學的檢出率、獲得接近50%的患者痰液病原學診斷而得以被更廣泛地應用。但對于經上述檢測結果為痰液病原學陰性肺結核患者，還可以通過支氣管鏡肺泡灌洗液(BALF)和超聲內鏡引導下的經支氣管針吸活檢(EBUS-TBNA)等深度病原學檢測技術獲得深部組織和分泌物，完成病原學檢查，進一步提高病原學檢出率以明確診斷，如GeneXpert MTB/RIF對支氣管鏡肺泡灌洗液檢測較痰液具有較高的敏感度和特異度[5]。另外，隨著病理學和分子病理學技術的推廣和應用，應用熒光定量聚合酶鏈式反應技術檢測石蠟組織中結核分枝桿菌脫氧核糖核酸(TB-DNA)，對提高肺結核活動性精準判斷也起到了積極作用[6-7]。因此筆者建議，應充分應用上述檢測技術的基礎上努力尋找病原學證據。

二、結核分枝桿菌抗原檢測

脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)是結核分枝桿菌重要的細胞壁組成成分，可作為靶抗原被側向流式檢測儀器(Alere Determine TB-LAM)在尿液標本中檢測到，具有快速、價廉、無創、不需要實驗室或技術支撐，以及能在床邊開展等優點。LAM檢測已被證明具有較高的準確度，主要適用于診斷CD4+T淋巴細胞計數水平低的HIV感染者是否并發結核病[8]，可提高此類患者的住院生存率[9]，已獲得WHO[10]認可。有研究正在評估痰液LAM檢測作為抗結核療效監測的效果，其中酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的方法取得了可喜的臨床試驗結果[11]。另一種有前途的方法是使用與質譜聯用的納米盤(NanoDisk-MS)鑒定結核分枝桿菌特異性肽片段，可以快速量化血液中結核分枝桿菌抗原；例如，可以快速檢測出抗結核治療后患者血清中培養濾液蛋白10(CFP-10)和早期分泌性抗原靶標6(ESAT-6)的下降水平[12]。但筆者認為，目前LAM檢測僅是一種有前途的研究，能否作為肺結核活動性判斷的評價指標仍需進一步臨床驗證。

三、炎性和急性期反應標志物

一系列活動性生物標記物可以用于診斷結核病和預測對抗結核藥品治療的反應，例如γ-干擾素(IFN-γ)誘導蛋白10(IFN-γ inducible protein 10，IP-10)[13]是多種細胞(包括單核細胞、內皮細胞和成纖維細胞)應答γ-干擾素而分泌的趨化因子，是單核/巨噬細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞的趨化劑，可促進T淋巴細胞黏附[14-15]。有研究發現，活動性結核病患者血清中可溶性IP-10的濃度明顯升高[16]，但在抗結核藥品進行治療后明顯下降，提示IP-10可能作為活動性判定的指標。另外，IP-10對診斷免疫抑制者并發結核病方面具有一定的優勢，可作為其診斷的輔助指標。C-反應蛋白(CRP)和血紅細胞沉降率(ESR)已被應用于判斷結核病的嚴重程度，預測治療后的影像學改善情況[17-18]。也有研究把7種可溶性血清標志物(包括IP-10、CRP、IFN-γ、血清淀粉樣蛋白A、補體因子H、載脂蛋白A1和甲狀腺素轉運蛋白)的相對水平作為一個整合的結核病診斷包[19-20]，用于區分結核潛伏感染和活動性結核病，但其應用價值還需進行多中心、大樣本研究以進一步證實。因此，目前檢測炎性和急性期反應標志物可作為活動性判斷評價的參考指標，但臨床價值仍然有限。

四、免疫學標志物檢測

盡管尚未完全闡明機體在結核感染后的免疫應答機制，但免疫應答相關指標對于診斷疾病和預測療效至關重要，尤其是T淋巴細胞的表型和功能性特征[21]。

1.T淋巴細胞表面標志物：T淋巴細胞經歷了抗原驅動分化的若干階段(早期、晚期和終末分化的效應細胞)，表現為一組細胞表面標志物的變化，這些標志物可作為結核分枝桿菌復制或抗原負荷的指標。例如，有研究發現，CD27、IFN-γ、CD4+T淋巴細胞的水平與肺部組織的破壞程度高度相關[22]。而T淋巴細胞活化標志物，如CD38、人白細胞抗原DR(HLA-DR)和細胞增殖抗原(Ki67)，也有希望成為結核病活動性判斷的指標[21]。

2.T淋巴細胞反應標志物：γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRA)檢測的原理是結核感染者體內存在特異性效應T淋巴細胞，這些細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌INF-γ。但IGRA與T淋巴細胞表面標志物相關檢測的優劣還需要更多的研究證實。

與結核菌素皮膚試驗(TST)相比較，IGRA與TST檢測均可用于結核潛伏感染的判斷[4]，但IGRA準確度高、假陽性少，且不受卡介苗和大多數非致病分枝桿菌的影響，尤其對于像中國這樣普遍接種卡介苗的結核病高負擔國家，IGRA具有更重要的意義。由于IGRA與TST檢測均無法準確預測結核潛伏感染個體是否會發展為活動性結核病，故均不得用于活動性結核病的診斷[23]；近期，出現了應用IGRA評估抗結核療效反應的研究，即從結核分枝桿菌特異性免疫應答的角度來評價抗結核療效，此領域的研究數量正在迅速增加。研究表明，結核病患者初診和治愈后的IFN-γ水平無明顯差異[24-26]。但也有一些研究結果顯示，活動性肺結核IFN-γ水平在抗結核藥品進行治療期間和治療后可以出現下降或轉陰，但也出現部分患者的免疫應答表現為持續上升的趨勢[27-28]。Pourakbari等[29]對IGRA[包括γ-干擾素釋放試驗中的Quanti FERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)、結核感染T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)、結核感染T細胞檢測試劑盒(QFT-Plus)等三種商業化檢測技術]在評估抗結核治療反應中的效果進行了系統綜述和Meta分析，結果表明：在抗結核治療期間監測QFT-GIT和T-SPOT.TB反應的變化可能對評估治療效果十分有限，而QFT-Plus的變化則有希望用于確定治療效果或進行治療監測。還有研究關注了T-SPOT.TB中結核特異性抗原孔(TBAg)斑點形成細胞數與陽性對照孔植物血凝素(PHA)形成斑點數的比值(TBAg/PHA ratio)，發現活動性結核病患者的TBAg/PHA比值明顯高于結核潛伏感染者，且在抗結核藥品治療過程中TBAg/PHA的比值會下降，提示該指標或可用于監測治療效果[30]。綜上，筆者認為目前IGRA在結核病活動性判斷中價值有限，有待進一步研究。

五、血液轉錄標志物檢測

Wang等[31]使用全基因組RNA測序方法，發現含腫瘤壞死因子受體超家族成員10C(TNFRSF 10C)、早期b細胞因子3(EBF 3)和a2-巨球蛋白樣蛋白 1(A2ML 1)的三基因集可對91.5%的肺結核個體進行正確分類，可將活動性肺結核與結核潛伏感染者區分開，敏感度和特異度分別為82.4%和92.4%。還有研究表明，Ⅰ/Ⅱ型IFN基因或IFN刺激基因的mRNA轉錄的全血白細胞表達升高與活動性結核病有關；且在結核感染患者中發現了幾種轉錄組特征性改變，并在抗結核藥品治療后下降[32]，提示這些標志物與結核病活動性相關。但這些檢測技術還未能獲得臨床大量研究，臨床意義有限，尚需進一步研究。

六、代謝組學檢測

宿主代謝產物的來源包括：(1)外源性代謝產物來自外部環境，并通過呼吸吸入或物質攝入(例如食物或藥物)。(2)體內產生的代謝產物可以是宿主生理代謝過程中的產物，也可以是微生物病原體代謝過程中的產物，或者是宿主對諸如感染或炎癥等過程中的病理反應性產物[33]。因此，宿主或病原微生物的新陳代謝變化可能會影響代謝產物組分。不同微生物種屬在人體組織微環境中生長代謝時產生的代謝產物種類不同，使得檢測其代謝譜和特異性物質成為可能。目前，代謝組學檢測的標本主要為血清、血漿、尿液、糞便[34]和呼出氣[35]。在結核病診斷方面，有研究使用氣相色譜與質譜聯用的方法，鑒定健康人和患者呼出氣中與結核病有關的揮發性有機化合物(volatile organic compounds，VOCs)，但其檢測準確度較低(80%～85%)[36-37]。Nakhleh等[38]進行了一項病例對照研究，認為基于納米材料的呼出氣診斷方法可能是診斷結核病的有用工具(準確度為92%)，但仍需更大的隊列研究以驗證結果。可見，代謝組學檢測目前不具備用于肺結核活動性判斷的意義。

七、 展望

目前，病原學陰性肺結核活動性判斷仍是臨床醫療實踐中的熱點及難點問題，其評價指標主要包括實驗室指標(結核分枝桿菌抗原、炎性和急性期反應標志物、免疫學指標、血液轉錄標志物等)、影像學指標(胸部X線、CT、MR、PET/CT)、病理學指標等。對于痰液病原學陰性的患者，推薦使用支氣管鏡下肺活檢、BALF、分子生物學檢測獲得病理學和病原學診斷依據；如仍不能明確，可通過觀察經驗性抗結核藥品治療(一般2個月療程)效果來評價其活動性。其中實驗室指標是最重要的評價依據，因此筆者結合相關文獻評價了實驗室檢測技術用于肺結核活動性判斷的臨床應用價值和前景，為臨床醫生提供了基本評價原則和方向。但仍有許多問題亟待解決：一是研發高效的生物標志物應用于肺結核活動性判斷，不斷提升其判斷準確度。二是開展活動性肺結核的臨床轉歸隨機對照研究，探索科學的實驗室檢測技術在活動性判斷體系中的評價作用。三是肺結核患者的并發癥、殘留損壞和結構性肺病也不容忽視，不僅可影響肺結核活動性的判斷，還可能影響實驗室檢測技術的敏感度和特異度。總之，在肺結核活動性判斷中需應用多種實驗室檢測技術綜合評估，才能解決患者精準治療和精準停藥的臨床問題。