蠐螬對激光損傷兔血-視網膜屏障后視網膜白細胞介素-1表達影響的研究*

★ 楊霞 蔣鵬飛 彭俊 彭清華 *** 張波濤 葉群如 江運長（.湖南中醫藥大學 長沙 40208；2.湖北航天醫院 武漢 42000；.湖南中醫藥大學第一附屬醫院 長沙 40007）

隨著激光在眼科檢查及治療的廣泛應用，由激光所致的醫源性視網膜光損傷也越來越多，許多眼科疾病的發生與視網膜長期光照的積累效應有關[1-2]，如老年性黃斑變性。中藥蠐螬是金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子或其他近緣昆蟲的干燥幼蟲，屬蟲類藥，味咸微溫，有毒，在眼科應用較早。《晉書》中有此藥治療目疾的記載：“吳中書郎戰沖，母王氏失明，婢取蠐螬蒸熟與食，王以為美，沖還知之，抱母慟哭，母目即開。”為觀察不同劑量蠐螬提取物在視網膜光損傷后組織抗炎癥反應中的作用，本研究應用不同劑量蠐螬提取物干預白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1），觀察其視網膜組織病理形態學改變，探討蠐螬提取物對視網膜光損傷兔模型保護作用的最佳劑量。

1 材料

1.1 實驗動物 選用30只健康實驗性兔，均為雄性，體重1.8～2.3Kg（湖南中醫藥大學動物實驗室提供，合格證號：醫動字第20-002號）。

1.2 主要實驗藥品和試劑 蠐螬提取物（參照參考文獻[3]所用制備方法制得）、Harris蘇木素（湖南中醫藥大學病理實驗室，批號：71020784）、PV9000型二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司，批號：zb-5301）、細胞裂解液（江蘇碧云天，批號：P0013）、羊抗兔二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB23303）。

1.3 主要儀器設備和手術器材 電子秤（上海天平儀器廠， JY0001）、眼科手術顯微鏡（蘇州醫療器械設備廠， YZZOT）、微量移液器（德國，eppendorf（1mL/200μL/10μL））、水平搖床（北京六一儀器廠，WD-9405B）、壓片夾（koda）、掃描儀（日本Canon，9000F MarkⅡ）。

2 實驗方法

2.1 分組方法 將30只實驗性兔依次編為1～30號，通過隨機數字表法：從隨機數字表第3行第5個數開始抄錄30個數，令這些數字除以5，余數為1劃入空白組（A），余數為2劃入模型組（B），余數為3劃入蠐螬低劑量組（C），余數為4劃入蠐螬中劑量組（D），余數為0劃入蠐螬高劑量組（E），最終使每組6只動物，12只眼。

2.2 造模方法 采用自制光化學損傷裝置[3]：在光照架的6個面分別放置1根40W的白色熒光燈管。調節光照強度，并用ZDS-10型數字式照度計測定大鼠活動水平多點照度，平均為2000±200 1x。動物房的室溫控制在21℃～24℃，光照箱內的平均溫度為22℃～25℃。所有實驗動物在12h明（30-50 1x）及12h暗環境下循環光環境適應7d，自由攝食飲水。7d后光照前先暗適應24h，然后光照12h（晚上8：00至次日早上8：00），再進行暗適應12h，連續3個循環，光照時間總計為36h。實驗性兔不散瞳及麻醉，可在光照箱內自由活動，光照后送回暗環境中飼養。A組不施行光照試驗。

2.3 給藥方法 A、B組每日以生理鹽水5mL/Kg灌胃；C組按照0.45g/Kg配成5mL蠐螬提取物混懸液；D組按照成人日用量10倍劑量灌胃，為0.9g/Kg蠐螬提取物配成5mL蠐螬提取物混懸液；E組按照成人日用量20倍劑量灌胃，為1.8g/Kg蠐螬提取物配成5mL蠐螬提取物混懸液。每日灌胃1次，給藥7d、14d分別處死3只兔子后取材做IL-1免疫組化檢測。

2.4 取材方法 動物耳緣靜脈注射空氣處死后，于角膜緣后0.5mm處剪開眼球壁，將眼球壁在手術顯微鏡下剝離激光斑部位視網膜，脫水、石蠟包埋后切片烘干備用。

2.5 指標檢測

2.5.1 HE染色觀察標本視網膜細胞結構 經脫水浸蠟、二甲苯溶液脫蠟、無水乙醇洗蠟、乙醇浸泡、自來水洗、蘇木素染色、乙醇鹽酸分色、伊紅染色、乙醇分色脫水、二甲苯溶液透明、中性樹膠封片等步驟，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.5.2 IL-1免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟，用PBS（0.01mol/L，pH=7.4）沖洗5min×3次，3% H2O2室溫孵育10min，蒸餾水沖洗，滴加IL-1單克隆抗體，室溫或37℃孵育1～2h，PBS沖洗2min×3次，滴加1：100比例稀釋的一抗，37℃孵育1h，PBS沖洗2min×3次，滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗2min×3次， DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復染，封片。在高放大倍率顯微鏡下觀察到IL-1蛋白的表達。標準如下：免疫組織化后，細胞質為棕色或深棕色為陽性標記。使用高倍顯微鏡隨機選擇5個視網膜視野用于圖像分析系統定量測量各個指標陽性積分光密度，以此表示它們的含量。

3 結果

3.1 各組實驗性兔視網膜組織HE染色結果 A組：實驗性兔視網膜結構層次分明。B組：視網膜層次結構模糊，分界不清，出現不規則淡染。C組：視網膜外核層胞核排列較疏松。D組：視網膜外核層增厚，視網膜外核層胞核排列較整齊密集。E組：視網膜外核層胞核排列較整齊，厚度有增加。具體見圖1。

3.2 各組實驗性兔視網膜IL-1的表達情況 A組視網膜外核層中IL-1陽性物質分布稀疏，含量較少；B組視網膜外核層中IL-1陽性物質彌漫分布，含量較多；其余各組視網膜外核層中IL-1陽性物質有不同程度減少。見表1。

表1 各組間大鼠視網膜IL-1表達的比較（，n=6）

表1 各組間大鼠視網膜IL-1表達的比較（，n=6）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別 第一周 第二周A組 6.08±3.46▲ 5.06±3.17▲B組 162.98±59.34＊ 101.48±13.09＊C組 74.64±9.31＊▲ 43.41±0.42＊▲D組 66.59±0.87＊▲ 32.63±2.26＊▲E組 67.26±1.46＊▲ 36.92±1.45＊▲

4 討論

眼底激光作為高能量的單色光，其對視網膜的灼傷屬于眼外傷范疇，多導致視衣氣陰受損，氣虛血瘀。目珠脈道幽深細微，經絡分布周密，氣血縱橫貫目，若激光灼傷目珠，氣陰受損，脈絡瘀滯，使神光發越受阻，視功能減退。目得陰血而能視，氣脫者目不明，神光賴其真氣真血真精之滋養，方能明視萬物。益氣則神光有所滋養，同時，氣旺以促血行；活血化瘀則目珠脈道通暢，氣血可以縱橫貫目，神光方能有所發越。故治療常以益氣活血化瘀為主，輔以養陰利水。蠐螬在《神農本草經》中最早有記載：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅滿痛，月閉，目中淫膚、青翳白膜。”蠐螬有活血化瘀之效，可針對視網膜光損傷的脈絡瘀滯病機治療。

由于持續的光照，活性脂肪酸代謝和高氧消耗，視網膜光感受器細胞發生慢性氧化應激[4-5]，導致細胞內循環和降解減少，誘導視網膜感光細胞的凋亡[6]。感光細胞的大量凋亡是視網膜光損傷后視力下降的主要原因[7-10]。

IL-1不僅是細胞炎癥因子，也是炎癥前細胞因子，IL-1聚集往往炎癥發生[11-12]。IL-1具有趨化和有絲分裂作用，還能引起組織產生增殖反應。在視網膜上，IL-1主要由視網膜Müller細胞表達，主要形式為IL-1β，IL-1β可以使視網膜組織間隙增大，有利于炎癥因子的滲出，從而加劇炎癥反映，破壞視網膜結構，尤其是血-視網膜屏障的破壞。

本實驗發現模型組IL-1表達增強，蠐螬中、高劑量治療組IL-1表達減少。這提示視網膜光損傷可能通過激活細胞炎癥反應，引起視網膜損傷，而蠐螬可能通過抑制細胞炎癥反應，對視網膜光損傷起到保護作用。