減味壽胎丸對藥源性卵巢功能損傷大鼠干預時機的探討*

★ 管雁丞 黃長盛 倪張俊 指導：羅頌平（.深圳市中醫院婦產科 廣東 深圳 58000；2.華中科技大學協和深圳醫院（深圳市南山區人民醫院）中醫（風濕）科 廣東 深圳 58052；.廣州中醫藥大學第一附屬醫院婦科 廣州 50405）

1 材料與方法

1.1 動物 SD雌性SPF級大鼠，重約220～250g（廣東省動物實驗中心，動物合格證號，SYXK（粵）2008-0001）。飼養于廣州中醫藥大學SPF級動物房。

1.2 試藥 減味壽胎丸：菟絲子、桑寄生、續斷按2：1：1比例混合，采用醇提與水提法，混合總提物，提取率為45%（廣東優力生物科技有限公司完成，樣品批號：201111030201-201111030204）。按人與大鼠體表面積折算系數6.25進行換算，即大鼠給藥劑量為1.875g/kg/d；低劑量組為1倍等效劑量，高劑量組為4倍等效劑量。

戊酸雌二醇（補佳樂）片（1mg/片，DELPHARM Lille S.A.S產，生產批號：278A），配置成0.5mg/mL藥物濃度。雷公藤多苷懸浮液（黃石飛云制藥有限公司，產品批號：20151203），配置成濃度為75mg/kg的懸浮液。

1.3 分組與方法 適應性喂養1周后選取有正常動情周期大鼠90只，隨機分成正常組、前期干預模型組、前期干預補佳樂組、前期干預中藥高、低劑量組，后期干預模型組、后期干預補佳樂組、后期干預中藥高、中藥低劑量組，每組各10只。

1.4 實驗方法 正常組分別于上午9時及下午3時灌服3mL生理鹽水，連續30天；早期干預模型組上午9時灌服GTW，下午3時灌服生理鹽水；早期干預用藥組上午9時灌服GTW，下午3時灌服減味壽胎丸或戊酸雌二醇，均連續30天。后期干預模型組在定時連續灌服GTW30天后，改予3mL生理鹽水，晚期干預用藥組改予減味壽胎丸或戊酸雌二醇，均連續30天，共60天。

1.5 觀測指標

1.5.1 動情周期的變化 觀察方法[1]如下：動情前期：全部見有核上皮細胞，偶見少量角化細胞。動情期：全部見無核角化細胞，間有少量白細胞。動情后期：細胞成分多，可見白細胞，角化細胞及有核上皮細胞。動情間期：可見有大量的白細胞及少量上皮細胞和粘液。

1.5.2 血清FSH、LH、E2、INHB、AMH的檢測 大鼠最后一次灌胃后1～5天內，選擇非動情期腹主動脈取動脈血、處死。血清FSH、LH、E2以RIA法測定（廣州中醫藥大學基礎醫學院核醫學實驗室完成）；血清INHB、AMH以ELISA法測定。

1.5.3 卵泡計數 大鼠處死后摘取雙側卵巢、子宮，并盡可能的剔除粘附脂肪等組織。將左側卵巢在電子秤上稱濕重后，計算卵巢指數、子宮指數。計算公式如下：

卵巢指數、子宮指數=卵巢、子宮重量/大鼠體重×100%

同時，將右側卵巢標本用10%多聚甲醛固定，包埋、切片，觀察卵泡計數。各級卵泡分類標準描述參閱文獻[1]。原始卵泡計數以卵母細胞核作為標記物。竇前卵泡和竇狀卵泡計數以卵母細胞核仁為標記物觀察每張切片。按照上述方法，計數每個標本卵泡及黃體數。采用單盲法獨立觀察所有切片。

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0進行數據處理和統計分析。以P＜0.05為差異有統計學意義

2 結果

2.1 動情周期 以兩個動情周期8～10天作為觀察點。結果表1-2。結果表明，前期干預模型組隨著造模時間的延長，在D11-D20已出現過半大鼠動情周期的紊亂、延長，到最后全部大鼠均出現動情周期的變化。前期干預西藥組及減味壽胎丸高、低劑量均可使部分大鼠動情周期恢復，其中，高劑量組有一半大鼠恢復正常的動情周期。后期干預模型組隨著造模時間的延長，動情周期未能恢復。后期干預西藥組及減味壽胎丸高、低劑量均可使部分大鼠動情周期恢復，但統計學上均無意義（P＞0.05）。

表1 大鼠前期干預動情周期的變化（n=10） 只

表2 大鼠后期干預動情周期的變化（n=10） 只

2.2 血清性激素水平變化 前期干預西藥組可明顯升高E2水平；前期干預西藥組、減味壽胎丸高、低劑量組均可明顯降低FSH、FSH/LH比值的水平，三組組間比較無差異；后期干預各治療組及各組LH組間比較均無明顯差異。

2.3 血清細胞因子比較 中藥低劑量組可明顯升高INHB、AMH水平，前、后干預各治療組均未見明顯變化。

表2 大鼠前、后期干預血清性激素的變化（，n=10）

表2 大鼠前、后期干預血清性激素的變化（，n=10）

注：與正常組比較，★P＜0.05。與前期模型組比較，*P＜0.05。與后期模型組比較，ΔP＜0.05。

組別 E2/pg·mL-1 FSH/mIU·mL-1 LH/mIU·mL-1 FSH/LH正常組 7.61±7.51 0.65±0.45 0.5±0.25 1.33±7.54前+模組 1.48±1.1★ 1.59±0.9★ 0.98±0.69 2.29±1.91★前+西組 4.73±4.54★* 1.10±0.21★* 0.89±0.15 1.22±0.44*前+中高組 2.76±3.08★ 0.95±0.15* 0.91±1.76 1.13±0.87*前+中低組 1.57±1.43★ 1.2±0.16★* 0.96±0.13 1.24±0.05*后+模組 1.10±2.14★ 1.26±0.34★ 0.73±0.44 1.24±0.09★后+西組 2.05±2.48★ 1.12±0.45★ 0.89±0.27 0.24±0.09后+中高組 2.52±3.08★ 1.11±0.35★ 0.82±0.22 1.33±0.18后+中低組 2.21±2.85★ 1.07±0.25★ 0.87±0.17 1.23±0.64

表3 大鼠前、后干預血清細胞因子的變化（，n=10） ng/mL

表3 大鼠前、后干預血清細胞因子的變化（，n=10） ng/mL

注：與正常組比較，★P＜0.05。與前期模型組比較，*P＜0.05。與后期模型組比較，ΔP＜0.05。

組別 INHB AMH正常組 41.1±5.17 10.06±1.23前+模組 35.81±3.61★ 8.4±0.94★前+西組 34.23±4.98★ 8.18±1.33★前+中高組 36.08±4.61★ 8.75±1.19★前+中低組 39.74±3.52★* 9.62±1.74*后+模組 33.35±4.62★ 8.65±1.15★后+西組 33.38±6.11★ 8.27±1.11后+中高組 37.18±1.95★ 7.94±0.75后+中低組 31.37±5.78★ 8.38±0.79

2.4 大鼠卵巢指數、子宮指數變化 前期干預中藥低劑量組可明顯升高卵巢指數，前后期干預組均未見子宮指數明顯升高。

表4 大鼠卵巢指數、子宮指數的變化（，n=10）%

表4 大鼠卵巢指數、子宮指數的變化（，n=10）%

注：與正常組比較，★P＜0.05。與前期模型組比較，*P＜0.05。與后期模型組比較，ΔP＜0.05。

組別 卵巢指數 子宮指數正常組 0.024±0.002 0.23±0.084前+模組 0.018±0.005★ 0.203±0.102前+西組 0.023±0.003 0.203±0.06前+中高組 0.020±0.003 0.15±0.015★前+中低組 0.026±0.005* 0.164±0.031★后+模組 0.014±0.053★ 0.169±0.06★后+西組 0.019±0.05Δ 0.15±0.023★后+中高組 0.023±0.003Δ 0.203±0.074后+中低組 0.017±0.005Δ 0.162±0.047★

2.5 大鼠卵泡計數比較 大鼠生長卵泡的比較：前期干預西藥組未能明顯使生長卵泡數量增加，減味壽胎丸高、低劑量組可使生長卵泡增加，但統計學上無意義。后期干預中藥高劑量組可明顯使生長卵泡數量增加。前期干預西藥組可使成熟卵泡/卵泡總數比值明顯升高；后期干預各組均可使比值升高，但無統計學意義。各組黃體數組間比較無明顯差異。

表5 大鼠前、后期干預卵泡計數的比較（，n=10）個

表5 大鼠前、后期干預卵泡計數的比較（，n=10）個

組別 生長卵泡 成熟卵泡/卵泡總數 黃體數正常組 12.5±5.66 0.25±0.06 5.4±3.03前+模組 11±7.02 0.17±0.08 4.2±1.93前+西組 8.8±6.56 0.41±0.26★* 3.5±2.59前+中高組 11.4±7.96 0.21±0.14 4.6±1.65

（續表）

3 討論

“治未病”最早見于《黃帝內經靈樞·順逆》，體現了中醫學預防為主的思想，是中醫理論體系的重要組成部分，在后世亦得到了不斷發展和完善，它包括了“未病先防”“既病防變”“瘥后防復”三個方面，三者的重點在于“防”。所謂未病先防，即著眼于未雨綢繆，保身長全，預防疾病的發生，是“治未病”的第一要義。

筆者研究團隊已多次重復并成功建立藥源性卵巢功能損傷大鼠模型，結果顯示75mg/kg，連續用藥30天模型穩定[2]；減味壽胎丸拮抗修復卵巢功能損傷效顯且三月齡性成熟大鼠干預效果最佳[3]。故本實驗基于“治未病”學說，將實驗設立為前期干預及后期干預兩個部分。前期干預即在灌服雷公藤的造模同時，給予治療藥物干預；后期干預即造模成功后，給予治療藥物干預，以觀察前期干預與后期干預的差異性，進一步探討雷公藤致卵巢功能損傷大鼠最佳干預時機，以期指導臨床用藥，減少藥物的副作用，提高藥物利用度。

結果表明，前期干預組，減味壽胎丸可使3月齡大鼠約半數動情周期恢復；可使FSH、FSH/LH明顯降低，E2、AMH、INHB水平明顯升高；可使卵巢指數明顯升高；可使成熟卵泡/卵泡總數比值明顯升高；可使生長卵泡增加，但統計學上無意義。后期干預組，中藥高劑量組可明顯使生長卵泡數量增加，未見明顯性激素及細胞因子的明顯變化。可見，前期干預對于卵巢功能損傷的修復效果更顯著，后期干預各組雖有效，但均無顯著性改善。

綜上所述，減味壽胎丸前期干預拮抗修復藥源性卵巢功能損傷顯效，后期干預無效。