嵌合抗原受體T細胞的研究進展

馮淑嫻，王 歌

(1.聯勤保障部隊第940醫院安寧分院婦產科，蘭州 730070； 2.中南大學湘雅醫學院臨床醫療系，長沙 410083)

目前，免疫治療是腫瘤治療的有效手段。T淋巴細胞具有極強的腫瘤細胞殺傷作用[1]。近年來，隨著腫瘤免疫學的發展，腫瘤治療中基因改造T細胞的發展迅速。單鏈抗體技術與T細胞活化基序結合應用的免疫治療技術可精確靶向并持久殺傷腫瘤細胞、改變腫瘤免疫抑制微環境、破壞宿主免疫耐受狀態，并可為過繼性細胞免疫治療提供新的有效解決方案，成為腫瘤免疫治療的有效方法。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)-T細胞是目前臨床免疫治療的主要細胞。CAR-T細胞可有效消除腫瘤干細胞亞群及其他腫瘤細胞，在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤等惡性腫瘤治療中均顯示出良好的抗腫瘤效應[2-4]。CAR-T細胞的臨床應用廣泛，但仍存在很多風險，在臨床治療中，準確找到腫瘤特異性靶點、改善免疫抑制微環境、有效控制CAR-T細胞成為目前腫瘤免疫治療的首要目標?，F就近年來CAR-T細胞的研究進展予以綜述。

1 CAR-T細胞的結構

CAR的胞外配體結合域由單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)組成，可通過跨膜區與胞內信號域連接[5]。CAR技術的基本原理是將scFv與T細胞的胞內區序列拼接，再通過逆轉錄病毒或慢病毒載體、DNA轉座子、電穿孔等技術進行基因編輯?；赗NA[CRISRP(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/caspase-9]及蛋白質(鋅指核酸酶、轉錄激活樣效應因子核酸酶)的基因編輯技術可有效敲除抑制性基因或誘導CAR-T細胞功能增強分子的表達。CAR與腫瘤相關抗原結合可活化CAR-T細胞，表現為CAR依賴的殺傷、增殖及細胞因子釋放。

CAR的結構一共經歷了四代發展[6]。第一代CAR將scFv與免疫球蛋白Fc受體的γ鏈或CD3復合體的ζ鏈融合，形成CAR-T細胞受體。第一代CAR-T細胞無共刺激分子，在體內存活時間較短，將協同刺激因子與CAR融合可活化共刺激分子和胞內信號域，增強T細胞功能。二代CAR-T細胞可在CD3結構域的上游融合1個協同刺激因子(如CD27、CD28、OX40、ICOS、4-1BB等)，三代CAR-T細胞的胞內區域可融合多個協同刺激因子。三代CAR-T細胞活化、增殖、分泌細胞因子和細胞毒素的作用更強，對三代CAR-T細胞親和力較低的分子也可促使三代CAR-T細胞的活化，但效果尚不確定。四代CAR-T細胞(也稱為TRUCK細胞)還可誘導轉基因產物的表達，如分泌細胞因子調節CAR-T細胞及機體免疫細胞的功能[7]。

2 影響CAR-T細胞治療效果的因素及解決方法

2.1脫靶效應 許多腫瘤抗原不僅在癌細胞高表達，還可在正常組織少量表達，增加了發生免疫治療脫靶殺死正常細胞的可能性，并可能發生交叉反應而靶向抗原結構相似的其他組織。設計串聯性CAR是提高特異性的方法之一，串聯性CAR由兩個串聯的靶向不同抗原的scFv組成，只有同時結合兩種抗原才能活化T細胞[8]。此外，還可通過T細胞共刺激或共抑制受體識別T細胞組合信號改善治療效果的自主控制，減少脫靶效應。

與門邏輯設計的雙抗原CAR-T細胞可表達攜帶CD3ζ鏈以及攜帶共刺激基序的兩種CAR，只有兩種CAR同時表達T細胞才能被完全激活并增殖[9]。與此相反，以非門邏輯設計的抑制性CAR是利用共抑制受體程序性細胞死亡受體-1或細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4的抑制性信號轉導鏈取代CAR胞質尾部的刺激性信號轉導結構域。當抑制性CAR與同時表達CAR和抑制性CAR抗原的細胞結合時，T細胞活性被抑制[10]。此方法需要進一步鑒定潛在脫靶組織的特異性抗原，以確定抑制性CAR的靶向抑制性抗原。

或門邏輯在CAR-T細胞識別腫瘤抗原中也具有重要作用。在腫瘤免疫編輯過程中，腫瘤細胞可通過抑制特異性抗原的表達實現免疫逃逸，或門邏輯設計的CAR可靶向B細胞CD19和CD20抗原，使缺失CD19的CAR仍具有抗腫瘤作用[11]。

有研究開發了synNotch(synthetic Notch)受體[12]。Notch蛋白為跨膜受體，其胞內結構域含有轉錄調節因子，當Notch蛋白與關聯的細胞外配體結合并誘導膜內蛋白水解后，該轉錄調節因子被切割釋放。synNotch受體保留了Notch受體中控制配體依賴性切割及胞質尾釋放的最小跨膜核心結構域，而其配體結合結構域和胞質結構域分別由scFvs和轉錄調節因子(如Gal4-VP64或tetR-VP64)取代。synNotch受體技術作為與門識別的新方法，通過激活配體誘導CAR的表達，并調節細胞殺傷作用。因此，在局部腫瘤微環境中，synNotch受體與抗原結合前的T細胞無細胞毒性成為識別抗原的更安全選擇。

細胞內腫瘤標志物一般不作為抗原，但其特異性較細胞外抗原更強。細胞內抗原通過主要組織相容性復合體Ⅰ在腫瘤細胞表面表達，T細胞受體具有識別細胞內抗原的能力，但T細胞受體的固有低親和性以及腫瘤細胞表面低密度的主要組織相容性復合體分子限制了T細胞受體的臨床應用。與低親和力T細胞受體相比，T細胞受體樣抗體不僅保留了T細胞受體的特異性，還具有高親和性。研究發現，多種T細胞受體樣抗體可靶向腫瘤及病原體衍生的多種主要組織相容性復合體Ⅰ肽復合體[13]。目前，已經研發出具有親和力的腎母細胞瘤抗原1(由人類白細胞抗原A2呈遞)人抗體[14]。在構建CAR時結合高親和力T細胞受體樣抗體，并將細胞內標志物作為潛在靶標，可提高CAR-T細胞免疫治療的特異性及安全性，但其對脫靶效應的識別潛力仍有待驗證。

2.2細胞控制 細胞控制是CAR-T細胞療法需要解決的主要難題之一。T細胞和其他免疫細胞均可導致細胞因子風暴，嚴重損害機體健康，因此基本細胞控制對細胞免疫治療的成敗十分重要。將自殺基因導入CAR-T細胞是控制細胞治療效果的方法之一。自殺基因指某些病毒或細菌中具有催化無毒藥物前體，并使其轉變為細胞毒物質的酶的基因。將自殺基因導入靶細胞可導致攜帶該基因的受體細胞死亡，如單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷自殺基因系統,胸苷激酶可催化丙氧鳥苷生成有細胞毒性的核苷酸，阻止DNA合成，進而導致細胞死亡[3]。在腫瘤細胞內表達的自殺基因可將無毒性前體藥物轉化為高毒性代謝產物，以殺傷腫瘤細胞，但其具有以下缺點：①病毒蛋白有免疫原性；②有效的DNA整合才能使腫瘤細胞的消除生效；③ T細胞清除需要的時間較長；④在單純皰疹病毒胸苷激酶基因中存在耐藥突變。

通過修飾免疫細胞信號傳遞通路是控制CAR-T細胞治療的另一方法。研究表明，icaspase-9包含一個FKBP12-F36V藥物結合域和一個caspase-9胞內段。FK506類似物(AP1903/AP20187)可誘導FKBP12-F36V的二聚化，激活caspase-9和凋亡通路，迅速驅動T細胞凋亡[15]。此外，通過敲除人表皮生長因子受體胞外結構域Ⅰ、Ⅱ及其胞內結構域并保留含有西妥昔單抗結合位點，可產生截短的人表皮生長因子受體，可見西妥昔單抗驅動的細胞毒性作用可清除表達CAR和截短的人表皮生長因子受體的T細胞[16]。但通過清除T細胞控制腫瘤發展的治療效果存在一定局限性：①若CAR-T治療造成患者損傷，即使清除99%的CAR-T細胞也無法完全抑制細胞的毒性作用；②若T細胞對藥物不敏感，即機體不表達相應受體，則無法清除腫瘤細胞；③患者體內CAR-T細胞清除后，可能導致治療終止或失敗。

調節T細胞的轉導激活信號能力是控制細胞活性的另一種方式，可通過將受體的配體結合域與胞質信號轉導鏈分開來實現，即“ON-switch CAR”，抗原和二聚化藥物同時存在才可激活，改變藥物濃度可有效調節CAR-T細胞的殺傷力和增殖活性[17]。與自殺基因控制相比，調節T細胞的轉導激活信號可更有效地控制治療性T細胞，但受到固定表達CAR的限制。小分子適配器可控制T細胞活性，如構建結合Fc結構的CD16V-BB-ζ抗體。小分子適配器無抗腫瘤作用，在體內與Fc結合后可促使T細胞激活，未經適配器刺激的細胞會“沉默”，不識別和靶向任何細胞。研究發現，含有異硫氰酸熒光素[18]或抗多肽新抗原表位[19]的腫瘤抗原特異性抗體適配器分子可以劑量滴定方式控制CAR-T細胞的活性、組織浸潤、細胞因子釋放和表型。通過使用不同的適配器分子可使CAR-T細胞靶向不同抗原，并通過構建細胞因子受體控制T細胞功能。

2.3免疫抑制微環境 腫瘤與免疫系統的相互作用是長期的動態變化過程，腫瘤發生伴隨免疫監視、免疫平衡、免疫逃逸3個階段，最終建立腫瘤免疫抑制微環境。免疫抑制微環境可影響CAR-T細胞的活性，抑制其抗腫瘤作用，改變腫瘤免疫抑制微環境對提高CAR-T細胞的療效十分重要。

解除免疫檢查點對T細胞的抑制作用是改變免疫抑制微環境的有效措施之一，如將程序性細胞死亡受體-1跨膜和胞質尾部替換為共刺激域，在結合檢查點分子后可促進細胞的激活或使用程序性細胞死亡受體-1/程序性細胞死亡配體1抗體。目前，一些實驗致力于通過CRISPR/caspase-9技術[23]使T細胞不表達程序性細胞死亡受體-1。此外，使用CRISPR/caspase-9進行異體基因敲除而產生的通用CAR-T細胞，有可能改善目前CAR-T細胞的療效。

細胞因子在腫瘤發展與免疫活動中有重要作用，通過T細胞修飾可使T細胞表達細胞因子受體基因或細胞因子基因，有助于改善免疫抑制微環境。有實驗顯示，IL-7在體外和體內均支持IL-7Rα、GD2特異性CAR、EB病毒特異性T細胞的增殖和抗腫瘤活性，且存在全功能調節性T細胞時也是如此[24]。另有實驗發現，表達IL-4胞外區的T細胞可被腫瘤產生的抑制性細胞因子IL-4激活，且僅在腫瘤微環境中發生，避免了CAR-T細胞對正常組織造成損傷[25]。IL-15可促進T細胞的增殖和存活，激活人記憶CD8+T細胞的端粒酶活性[26]，并在T細胞表達時，促進干細胞記憶表型[27]。

另外，賦予CAR-T細胞主動重構腫瘤微環境的能力，如使CAR-T細胞表達炎癥因子IL-12、IL-2、IL-15等均顯示T細胞在腫瘤抑制性微環境中能力增強。實驗發現，通過基因修飾可使CD19的CAR-T細胞表達單純皰疹病毒受體，其與配體結合后可改善免疫抑制微環境[28]。synNotch受體是誘導刺激性細胞因子、趨化因子、抗體(包括檢查點抑制劑)、雙特異性抗體和先天性免疫刺激分子等表達的有效載體[29]。因此，可以通過synNotch受體設計CAR-T細胞，以增強CAR-T細胞識別腫瘤和重構腫瘤微環境的能力。

2.4CAR-T細胞的浸潤 與血液腫瘤相比，CAR-T細胞在實體腫瘤中的浸潤更困難，這可能是CAR-T細胞對實體腫瘤治療效果不佳和易復發的原因。不同給藥途徑在CAR-T細胞實體腫瘤浸潤中所起的作用不同，如采用胸腔內注射的抗間皮素CAR-T細胞的抗腫瘤療效優于全身使用[30]。另一方面，CAR-T細胞可主動改變腫瘤微環境，提高CAR-T細胞的浸潤。研究發現，體外擴增的T細胞可下調乙酰肝素酶信使RNA的表達，使T細胞降解細胞外基質中硫酸乙酰肝素蛋白多糖的能力降低。通過T細胞表達乙酰肝素酶可使輸注的T細胞更好地降解實體腫瘤細胞外基質，提高其浸潤能力[31]。此外，CAR-T細胞表達趨化因子受體還可增強腫瘤浸潤。研究表明，BLT1和CXCR3通過促進CD8+T細胞向腫瘤細胞的遷移來調節抗腫瘤免疫[32]。除響應天然配體外，研究還設計了能向生物惰性小分子定向遷移的T細胞[33]。通過對表達G蛋白偶聯受體T細胞的基因修飾，促使T細胞向生物惰性小分子氯氮平-N-氧化物遷移，此模式中，受體不響應天然配體，惰性藥物不結合天然細胞，T細胞的靶向能力得到提高。

3 結 語

CAR-T細胞免疫療法作為免疫治療的新技術已成功應用于血液腫瘤治療，為實體腫瘤患者的治療帶來新希望。然而，CAR-T免疫療法在實體腫瘤的應用還面臨諸多困難。實體腫瘤的異質性決定了其治療必須與細胞本身的特點、作用規律等因素相結合。目前，研究人員正試圖通過多方面的探索尋找更多的腫瘤抗原，以提高靶點的特異性或選擇多個靶點進行治療；通過進一步對T細胞進行修飾，促進CAR-T細胞向腫瘤組織的遷移浸潤，解除腫瘤微環境的免疫抑制性，最終提高CAR-T細胞在實體腫瘤中的抗腫瘤效果。隨著合成生物學和基因組工程的不斷發展，模塊化基因編碼工具的開發將推動CAR-T細胞治療的不斷完善，從而促進腫瘤精準細胞免疫治療的發展。