Nrf2-ARE通路與腫瘤耐藥的研究進展

康 意，張 靜，王曉玲，汪 濤

(天津中醫藥大學，天津 300193)

隨著飲食結構變化、環境污染加重、人口老齡化趨勢加速，惡性腫瘤的發病率在全球呈上升趨勢。據2013年統計，世界人口標準化惡性腫瘤發病率為186.15/10萬，中國人口標準化惡性腫瘤發病率為190.17/10萬[1]。目前治療惡性腫瘤的手段包括化療藥物控制、放療、免疫治療等，其中藥物治療有不可替代的作用，利用化療藥物誘導腫瘤細胞死亡和(或)抑制腫瘤細胞存活是癌癥治療的主要原則。但是大劑量化療藥物的毒副作用及藥物的多耐藥性(multidrug resistance，MDR)已成為臨床治療腫瘤的瓶頸，也是臨床腫瘤化療失敗的主要原因，因此探究有效預測腫瘤化療敏感性的分子標志物以及多藥耐藥逆轉的分子靶點是惡性腫瘤治療研究的重點[2]。腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性已成為腫瘤研究迫切需要解決的問題，參與細胞抗氧化應激反應的核轉錄相關因子2-抗氧化反應元件(nuclear factor erythroid-2 related factor 2-antioxidant response element，Nrf2-ARE)通路在腫瘤細胞MDR的產生中發揮關鍵作用。Nrf2-ARE通路能通過Keap1、Nrf2等信號節點基因的突變影響Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶系及藥物轉運體等蛋白的表達和(或)與腫瘤細胞自噬的交互作用參與腫瘤細胞MDR的每個環節。針對Nrf2-ARE通路開展腫瘤細胞MDR的研究有重要意義?，F就Nrf2-ARE通路與腫瘤耐藥的研究進展進行綜述。

1 Nrf2-ARE通路及其調控機制

Nrf2-ARE通路是細胞抗氧化應激反應的中樞調控點，是細胞抵抗各種環境及內源性應激機制中必不可少的部分。在細胞遭受氧化損傷后，激活Nrf2可誘導ARE依賴性的多種解毒酶和抗氧化防御蛋白表達，以增強細胞降解或清除有害物質的能力，在抗腫瘤、抗炎癥及抗應激反應等方面發揮廣泛的細胞保護作用。Nrf2-ARE通路已成為腫瘤化療作用的靶點，但Nrf2在腫瘤細胞中過度激活也與腫瘤的演進及腫瘤化療耐藥有關。Nrf2-ARE通路主要有兩種基本的激活途徑：經典通路是指Nrf2在與其負調控蛋白Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1，Keap1)的非活性復合物解離后，入核易位發揮核轉錄因子作用的過程，這是Nrf2激活的主要機制；非典型通路是指許多蛋白通過與Nrf2競爭結合Keap1，穩定核內Nrf2的量，參與此通路的激活[3-8]。

1.1Nrf2-ARE通路經典激活途徑 細胞內Nrf2含量和功能主要受Keap1分子調控。Keap1是與胞質肌動蛋白結合的一種多肽，分子量為69 000，在轉錄后水平對Nrf2的活性進行負向調節[3]。核轉錄因子Nrf2是一種帽和領家族成員，分子量為 66 000，分子C端含有一個高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結構，該結構有助于其形成異源二聚體與細胞DNA上的ARE元件結合。在正常生理狀態下，Nrf2被Keap1錨定在肌動蛋白細胞骨架上滯留于細胞質，作為Cul3-E3泛素蛋白酶體底物，經泛素化降解，核中僅有少量的Nrf2發揮維持基本轉錄水平的作用。當細胞遭受氧化應激或在化學親電子試劑作用后，由于Cul3-E3泛素蛋白酶失活或Nrf2與Keap1解離，不能被泛素化降解的Nrf2大量入核，與ARE序列結合，啟動受ARE調控的一系列內源性抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶及藥物轉運泵等相關基因的表達，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、血紅素氧化酶1、醌氧化還原酶1、谷胱甘肽S轉移酶及多藥耐藥蛋白等[4-6]。

1.2Nrf2-ARE通路非經典激活途徑 研究表明，Nrf2-ARE通路也可通過不同的蛋白激酶磷酸化Nrf2被激活。促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等蛋白激酶均能直接磷酸化Nrf2，使其從Keap1復合物上解離，發生核易位來調控ARE下游靶基因的表達，進而活化Nrf2-ARE通路[7]。此外，自噬相關蛋白p62亦能通過激活Nrf2-ARE通路參與細胞抗氧化應激反應。p62蛋白中Keap1作用區(Keap1-interacting region,KIR)結構的S351磷酸化后，p62與Keap1親和力增強，與Nrf2競爭更多地結合于Keap1，并通過自噬途徑將Keap1降解，使Nrf2大量入核并在細胞核內穩定累積，激活Nrf2通路[8]。因p62轉錄增強子上含ARE序列，p62在蛋白質表達水平上也被Nrf2調控，p62與Nrf2-ARE通路形成一個抗氧化反應的正反饋環路[9]。

2 腫瘤細胞的多耐藥機制

臨床腫瘤化療失敗的主要原因是腫瘤細胞產生MDR，腫瘤細胞不僅對一種抗癌藥物產生抗藥性，也對其他結構和作用機制不同的抗癌藥物產生交叉耐藥。腫瘤多耐藥機制復雜，涉及多個方面，如腫瘤細胞內藥物的濃度降低，藥物代謝解毒，DNA損傷修復功能失衡、腫瘤細胞自噬及凋亡異常等。

2.1腫瘤細胞藥物轉運相關蛋白的異常表達 藥物轉運相關蛋白能夠將細胞內的化學藥物外排，降低細胞內藥物濃度，減弱藥物的細胞作用，使細胞產生耐藥性。MDR1基因編碼的P-糖蛋白是目前研究最多的多藥耐藥蛋白之一，屬于ATP結合盒轉運蛋白超家族成員之一，存在于細胞膜上，是與藥泵作用類似的能量依賴性轉運蛋白。高表達P-糖蛋白的腫瘤細胞能將不同結構和作用方式的化療藥物排出細胞，降低細胞內化療藥物濃度，致使腫瘤細胞對許多化療藥物的敏感性降低而產生耐藥性。研究發現，蛋白激酶抑制劑LY294002能通過減少P-糖蛋白蛋白表達，直接抑制P-糖蛋白功能，使腫瘤細胞內化療藥物的濃度升高，逆轉耐藥株KB/VCR細胞的多藥耐藥性[10]。研究發現，短發夾RNA可以有效抑制MDR1信使RNA的轉錄和P-糖蛋白的表達，使耐藥株BIU-87/阿霉素細胞對阿霉素的敏感性增加而產生耐藥[11]。研究提示，miR-451能夠負向調節P-糖蛋白的信使RNA及蛋白的表達，從而提高卵巢癌細胞A2780的耐藥性[12]。

2.2體內化療藥物代謝酶系統的異常表達 與腫瘤耐藥相關的體內酶系統有3類：①抗氧化及解毒酶系，如谷胱甘肽/谷胱甘肽S轉移酶體系。研究表明，許多腫瘤的耐藥細胞內高表達谷胱甘肽/谷胱甘肽S轉移酶，使用各種谷胱甘肽系統的抑制劑與谷胱甘肽類似的谷胱甘肽S轉移酶前藥能有效降低腫瘤耐藥細胞對化療藥物的敏感性。化合物3ATA(3β-acetyl tormentic acid)能通過降低小細胞癌GLC4/阿霉素耐藥細胞株內谷胱甘肽的水平，使腫瘤細胞的死亡率明顯提高[13]。②Ca2+依賴性蛋白激酶體系，如MAPK、PKC等。研究證實，MAPK通路的多個主要家族成員(胞外信號調節激酶、c-Jun氨基端激酶及p38激酶)的調節劑能通過影響P-糖蛋白的表達或藥物轉運活性干預腫瘤多藥耐藥過程[14-16]。PKC廣泛分布于各種組織細胞，介導細胞間信號轉導并調控多種重要基因的表達，與腫瘤發生和化療耐藥關系密切。PKC參與胰腺癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞耐藥相關蛋白的合成。PKC系統抑制劑可有效提高化療藥物殺死腫瘤耐藥細胞的比例，PKCα的抑制劑Ro-31-7549可增加乳腺癌巨噬細胞趨化因子7/阿霉素耐藥細胞株對阿霉素的敏感性，且PKCα的活性與耐藥呈正相關[17]。③可催化切斷DNA磷酸二酯鍵的核酶，如拓撲異構酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ，TopoⅡ)。TopoⅡ不僅與惡性腫瘤細胞無限增殖調控機制有關，還參與具有外排功能膜蛋白的合成過程，使腫瘤細胞產生耐藥性導致化療失敗。許多化療藥物均以TopoⅡ為重要靶點，通過影響TopoⅡ的功能而產生抗癌作用。抑制人腫瘤細胞TopoⅡ活性可降低耐藥株細胞化學抵抗，加速腫瘤細胞凋亡[18]，如在多發性骨髓瘤細胞上敲低TopoⅡ可顯著降低腫瘤細胞對化療藥阿霉素的耐藥性[19]。

2.3腫瘤細胞DNA損傷的異常修復 臨床治療腫瘤時，常使用的化療藥物如順鉑、阿霉素及5-氟尿嘧啶等均可造成腫瘤細胞DNA損傷，發揮抑制細胞增殖或促進細胞凋亡的作用，但腫瘤細胞DNA反復損傷可誘發DNA修復系統活性異常活躍，導致腫瘤細胞產生化療耐藥。臨床研究發現，通過同源重組方式修復DNA雙鏈斷裂損傷能使肺癌患者發生順鉑耐藥[20-21]。陳遞林等[22]通過對比耐藥組、化療敏感組宮頸癌患者術后標本修復交叉互補基因1(excision repair cross complementing 1，ERCC1)的基因表達檢測結果發現，與化療敏感組患者相比，耐藥組ERCC1基因核酸以及蛋白水平均明顯偏高，ERCC1基因異常表達可能是鉑類藥物化療治療宮頸癌產生耐藥的主要因素。試驗研究發現，經ERCC1-干擾小RNA轉染的肺腺癌細胞對順鉑敏感性升高[23]。

2.4自噬 自噬貫穿于真核細胞生長發育和生理病理過程，是普遍存在的重要生命現象，是細胞為應對不利的微環境壓力而被激活的溶酶體降解過程，類似于一種自身適應機制。對于細胞穩態維持機制，自噬是重要的參與者，但對腫瘤細胞，自噬發揮抑制作用還是促進作用尚未有明確定論，許多學者認為自噬具有“雙刃劍”效應[24]。在機體處于健康狀態下，細胞通過自噬途徑來清除已損壞的細胞器，回收可利用的生物大分子，防止細胞惡變，進而預防機體產生腫瘤；但若機體已產生腫瘤，腫瘤細胞能利用自噬途徑應對腫瘤生長過程中的營養缺乏、缺氧、缺乏生長因子等代謝壓力，或通過自噬清除放化療時受損的生物大分子或細胞器，使腫瘤細胞耐受放化療毒性作用，逃避細胞凋亡而生存下來。研究發現，多發性骨髓瘤細胞的Kruppel樣因子4能與泛素化連接蛋白p62/SQSTM1(Sequestosome 1)基因的啟動子結合，增強多發性骨髓瘤細胞自噬能力，使多發性骨髓瘤細胞對化療藥蛋白酶體抑制劑carfilzomib產生耐藥[25]。研究證實某些miRNAs能逆轉白血病細胞株的化療耐藥性。miRNAs是一類通過信使RNA轉錄后調控來影響基因表達的小RNA分子，其中miR-30A可通過調控短發夾RNA模擬或敲低Beclin 1和自噬基因5等自噬基因，下調自噬基因的表達，抑制伊馬替尼誘導的自噬，逆轉慢性粒細胞白血病細胞耐藥性產生[26]。

2.5細胞凋亡通路阻斷 細胞凋亡是一種程序化的細胞死亡形式，其結果是有序而有效地移除體內受損的組織細胞。細胞凋亡改變不僅影響腫瘤的發生發展，也是腫瘤細胞產生耐藥性的重要原因之一。目前用于臨床治療的大多數抗癌藥都是通過調控凋亡途徑來誘發癌細胞死亡，但在治療過程中由于某些原因腫瘤細胞凋亡受到抑制，造成腫瘤細胞化療耐藥。腫瘤多耐藥機制與細胞凋亡的兩種核心途徑均有關，即外源性死亡受體途徑和內源性死亡受體途徑。細胞凋亡途徑由多種調節和執行元件構成，是精細而復雜的網絡調控系統，任何凋亡相關蛋白表達異常或功能缺陷均可導致腫瘤細胞凋亡抵抗，進而產生化療耐藥，促凋亡因子和抑制凋亡因子的穩態維持在腫瘤耐藥過程中起重要作用。針對骨肉瘤的敏感細胞株和耐藥細胞株進行Bcl-2基因的含量測定，發現敏感細胞株中Bcl-2的含量遠低于耐藥細胞株[27]。利用RNA干擾技術下調鼻咽癌細胞株CNE1抗凋亡蛋白Bcl-2基因的表達后，發現CNE1細胞的增殖不受影響，但對順鉑的藥物敏感性顯著增強[28]。

3 Nrf2-ARE通路參與腫瘤細胞的耐藥過程

在腫瘤演進過程中，腫瘤細胞會因基因突變或通過化療藥物的選擇對臨床放化療治療產生耐受性，而Nrf2-ARE通路可參與其中的每個環節。

3.1Keap1/Nrf2基因突變與腫瘤耐藥 在食管、皮膚及肺等器官的鱗狀細胞癌中常出現Nrf2基因突變，突變后Nrf2蛋白仍保留轉錄活性，卻失去與Keap1的結合能力，其下游靶基因的表達不受Keap1介導的負性調控，進而使腫瘤細胞能耐受放化療。腫瘤耐藥細胞不僅存在高表達Nrf2的情況，也在肺、肝膽、卵巢及乳腺等腫瘤中發現因Keap1突變引起的Nrf2-ARE通路激活，Keap1的突變或異常低表達也是腫瘤耐藥的重要機制之一。在生理狀態下，野生型Keap1可以結合到IκB激酶β抑制劑分子上，抑制IκB激酶β磷酸化和介導自噬依賴的IκB激酶β降解，參與有促炎和促癌作用核因子κB信號的負調控。若Keap1基因發生突變，腫瘤細胞內的核因子κB通路被激活，腫瘤細胞增殖能力增強，可耐受化療藥物的作用[29]。研究發現，與正常呼吸道上皮細胞相比，Keap1在肺癌細胞系和組織中的表達降低，且Keap1的啟動子呈高甲基化狀態，Keap1表達量降低可能與癌細胞表觀遺傳學變化有關[30]。

3.2Nrf2-ARE通路的活化與腫瘤耐藥 在長期的化療藥物治療過程中，腫瘤細胞往往通過多種途徑獲得耐藥能力，使適應性的腫瘤細胞群體選擇性增多?；熕幬锎碳つ[瘤細胞產生高水平的活性氧類，在持續的氧化應激條件下，腫瘤細胞激活氧化還原敏感的轉錄因子Nrf2，使Nrf2-ARE通路下游靶基因如Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶系及藥物轉運體等蛋白表達上調，而這些蛋白大多在抗腫瘤藥物的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相代謝過程中發揮作用，能增強腫瘤細胞對抗氧化應激和化療藥物的能力，導致耐藥性逐漸增強。順鉑及烷化劑等抗癌藥物通過激活腫瘤細胞Nrf2-ARE通路，使受其調控的抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶及藥物流出泵蛋白的表達增加，從多個步驟促進化療藥物體內代謝，增強腫瘤細胞的MDR。可見，Nrf2是一種可被腫瘤細胞在解毒、抗氧化及化療藥物泵出等多個環節利用的保護性轉錄因子。研究發現利用藥物控制Nrf2的表達水平和活性可抑制胰腺癌細胞的生長，并能增加其對化療的敏感性[31]。化療藥物5-氟尿嘧啶通過激活Nrf2-ARE通路，可顯著增加人結腸癌HT-29細胞的耐藥性[32]；研究發現，Nrf2抑制劑鴉膽子苦醇可加速Nrf2的泛素化過程，降低細胞內Nrf2水平，增強順鉑對肺癌A549細胞毒性，進而使順鉑對癌細胞的殺傷程度進一步加強[33]。與單用順鉑的異種移植A549細胞的裸鼠組相比，鴉膽子苦醇和順鉑共處理組在誘導細胞凋亡和抑制腫瘤生長方面有顯著效果；Nrf2低表達的A549-K異種移植裸鼠對鴉膽子苦醇處理無反應，表明鴉膽子苦醇介導的對順鉑的致敏作用依賴于Nrf2的表達[34]。藥物能通過抑制Keap1或Nrf2的功能有效干預Keap1-Nrf2-ARE通路，克服腫瘤細胞化療耐藥，因此在未來臨床治療腫瘤時Keap1-Nrf2-ARE通路是潛在的抗癌藥物作用的靶點，是提高化療效果的新途徑。

3.3Nrf2-ARE通路與自噬串話參與腫瘤耐藥 研究發現，自噬和Nrf2-ARE通路存在交互作用，通過發揮增強防御、加速藥物代謝等作用促進腫瘤的演進，參與放化療的耐受過程。多功能蛋白p62是參與細胞自噬體構成的調節因子之一，可將綁定的泛素化蛋白聚合體運送至自噬體進行酶解。p62可直接與Keap1相互作用，使Keap1與泛素化合物-自噬體連接降解，轉錄因子Nrf2入細胞核后，激活ARE調控的下游一系列細胞保護性基因的表達。在丙型肝炎病毒陽性患者的肝癌細胞內，持續磷酸化的p62與Keap1親和力增強，介導Keap1降解后，激活Nrf2-ARE通路參與肝癌細胞的發生、發展；若敲除肝癌細胞細胞系中的p62可顯著抑制腫瘤生長[35]。此外，Nrf2還誘導p62表達，導致Nrf2通過p62-Nrf2-Keap1通路的正反饋環持續激活。與卵巢癌A2780細胞相比，A2780cp耐藥細胞過表達Nrf2及其靶基因醌氧化還原酶1和血紅素氧化酶1，抑制A2780cp細胞Nrf2通路可降低p62mRNA和蛋白的表達，增加A2780cp細胞對順鉑治療的敏感性，Nrf2激活的自噬可能是引起卵巢癌耐藥細胞株A2780cp順鉑抗性的原因[36]。但也存在不同的結論，用哺乳動物雷帕霉素和天然植物產物烯丙基巰基半胱氨酸干預結直腸癌HCT-116細胞和結直腸癌鼠模型時，發現激活的Nrf2-ARE通路上調其下游抗氧化基因醌氧化還原酶1的轉錄表達，同時p62表達下調，提示p62在Nrf2與自噬之間存在負調控作用[37]?？拱┧幬锟稍诓煌潭壬险T導多種類型癌細胞發生自噬和(或)激活Nrf2通路，進而對細胞存活產生不同的影響，關系極為復雜，這可能與癌細胞的遺傳背景、決定細胞命運的相關通路間的交互作用有關?；谧允赏緩胶蚇rf2-ARE通路探討腫瘤細胞化療耐藥機制，解析腫瘤細胞耐藥原因，對研發新型抗癌靶標藥物有重要的現實意義。

4 小 結

腫瘤的演進過程與腫瘤細胞基因突變、表觀遺傳學改變及多條通路交互作用積累有關，是一個漸進式過程。在臨床治療過程中，腫瘤細胞MDR也同樣涉及以上各個環節，宿主因素、癌細胞的特定遺傳背景改變、調控細胞增殖分化及應對應激因素等相關信號通路的交互反應都決定著癌細胞命運轉歸，其中Nrf2-ARE通路是參與腫瘤MDR各個環節的關鍵通路，并與自噬相關蛋白p62有復雜的交互作用。目前腫瘤細胞MDR機制已初步明確，但仍未得到有效的解決途徑，故進一步針對Nrf2-ARE通路導致腫瘤化療抵抗與耐藥的研究仍非常必要。